Évaluation des marqueurs salivaires chez les patients avec parodontite agressive

Les marqueurs salivaires et parodontite sont au cœur de cette étude, qui analyse l’impact des marqueurs oxydatifs, tels que la catalase et les protéines carbonylées, sur les patients souffrant de parodontite agressive. L’objectif est de déterminer le rôle du stress oxydatif dans cette pathologie.

Chapitre Ⅳ

La partie Pratique

1. Matériels et Méthodes

Introduction- Problématique :

Les maladies parodontales sont des maladies infectieuses, d’origine microbienne et inflammatoire, très répandues parmi la population adulte. Ces maladies se caractérisent par une destruction des tissus de soutien de la dent, la résorption de l’os alvéolaire et la perte des dents. On attribue le pouvoir pathogène à un nombre restreint de bactéries à prédominance anaérobie à Gram négatif. Elles impliquent une endotoxine bactérienne ainsi que des réactions inflammatoires.

Les mesures cliniques de la maladie parodontale, basées sur la profondeur des poches parodontales et la perte d’attache clinique, sont des données primordiales pour le diagnostic et le contrôle de l’évolution de la maladie.

Les paramètres oxydatifs et inflammatoires présents lors de l’inflammation et de la destruction du parodonte ont sans doute un potentiel de fournir des informations sur les signes et le développement de la parodontite. La découverte d’indicateurs précoces de la maladie, détectés dans les échantillons salivaires de l’hôte, pourrait améliorer le diagnostic et le traitement de la maladie parodontale.

L’objectif de l’étude :

Notre objectif est d’évaluer les marqueurs oxydatifs de la salive chez les patients atteints d’une parodontite agressive comparée aux témoins.

2.1- Cadre d’étude :

Notre pratique a été réalisée au sein de laboratoire central unité d’immunologie de l’Hôpital Militaire Régional Universitaire d’Oran (HMRUO).

Population d’étude :

Elle inclut tous les patients atteints de parodontite agressive consultants au service de parodontologie, de la clinique dentaire CHU d’Oran ont été soumis à un examen parodontal complet par un parodontiste du service et qui présentent les critères suivants :

3.1- Critères d’inclusion :

• sujets ayant des caractéristiques cliniques et radiographiques des parodontites agressives selon la nouvelle classification (ARMITAGE 1999).
• patients indemnes de toute pathologie d’ordre général.
• sujets âgés de 15 ans à 32ans.
• sujets n’ayant pas bénéficiés d’un traitement parodontal antérieur.
• sujets présentant au minimum 23 dents sur l’ensemble des arcades.

3.2- Critères d’exclusion :

• Les patients atteints d’une parodontite chronique
• Patients présentant une pathologie systémique.
• Sujets qui ont déjà bénéficiés d’un traitement parodontal.
• Sujet ayant pris un traitement antibiotique et / ou anti-inflammatoire dans les 6 mois.
• Grossesse.
• Alcool, Tabac

3.3- La collection de la salive :

La collection a été confirmée par l’encadreur, le protocole clinique de recueil salivaire selon la méthode de Navazesh (1993) :

• La salive est prélevée le matin à distance des repas.
• 15 minutes avant le prélèvement, le patient doit se rincer la bouche et boire un verre d’eau afin de favoriser la salivation.
• La salive prélevée est la salive totale non stimulée. Les patients devraient être au repos, en position assise et la tête légèrement penchée en avant et les lèvres légèrement entrouvertes pour laisser écouler la salive et qui vont permettre de recueillir la salive dans des tubes de polypropylène stérile a vissé .Le temps de prélèvement est fixe (3 à 5 minutes).
• Le tube de prélèvement salivaire est identifié.
• Les échantillons salivaires peuvent être directement congelé à -40°C, au moment du dosage la salive sera décongelée.
• Au moment de la réalisation des analyses, la salive a été décongelée et clarifiée par une étape de centrifugation à 3500 x g pendant 3 minutes.

3.4- Les paramètres buccodentaires:

3.4.1- Le sondage:

Permet de mettre en évidence deux paramètres essentiels, la profondeur de la poche parodontale et la perte d’attache. Il permet également la réévaluation après le traitement. Le sondage s’effectue pour toutes les dents présentes à l’aide d’une sonde parodontale graduée sur six points (mésial, central, distal en vestibulaire et en lingual).

• La profondeur de poche : est définie comme étant la distance séparant la bordure gingivale et le fond de la poche.
• La perte d’attache clinique : correspond à la distance séparent la jonction émail cément et le fond de la poche.

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Source : FIGURE 9 : LA SONDE PARODONTALE GRADUEE (COULOMB, A. 2002)

3.4.2- La récession parodontale:

Représente la distance entre la jonction émail-cément et rebord gingival. Le calcul de la moyenne de la récession se fait de la même manière que la profondeur de la poche et la perte d’attache clinique.

4- Matériels et Méthodes :

4.1- Matériels :

4.1.1- Les Réactifs :

Les Réactifs de la méthode d’estimation de l’activité de la catalase:

• Tampon phosphate de sodium- potassium (50 mM, pH 7,4).
• H2O2 (20 mM) dans 50 mmol / l de Tampon phosphate de sodium- potassium.
• Molybdate d’ammonium (32,4 mmol/l).

Les Réactifs de la méthode de dosage des protéines carbonylés :

Hcl 2,5 M.

• DNPH (2,4-dinitrophénylhydrazine) : est utilisée comme test caractéristique des aldéhydes et des cétones.
• TCA (Acide Trichloracétique) à 20% : L’acide trichloracétique est utilisé en laboratoire pour la précipitation des protéines. Bien que cette méthode de précipitation soit l’une des plus répandues.
• Mélange éthanol-acétate d’éthyle (1 :1, v : v) : Immédiatement avant l’utilisation, mélanger des volumes égaux d’éthanol et acétate d’éthyle dans un récipient en verre. Utilisez immédiatement. Ne pas stocker la solution de lavage.
• Guanidine hydrochloride 6M : Les sels de guanidine ils sont utilisés pour provoquer la dénaturation des protéines. Préparer 15 ml de Guanidine hydrochloride 6M pour 8.5977g de Guanidine dans 7.5 ml d’H2O. Une fois dissoudre compléter à15 ml d’H2O.

4.1.2- Les appareils : (Voir l’annexe).

4.2- Méthodes :

A- Méthode d’estimation de l’activité de la catalase salivaire :

Principe de la méthode :

On a suivi la méthode de M. Hadwan et H. Najm Abed en 2016, qui se base sur la réaction du peroxyde d’hydrogène non décomposé avec du molybdate d’ammonium pour produire une couleur jaunâtre, qui a une absorbance maximale à 374 nm. La méthode est caractérisée en ajoutant un facteur de correction pour exclure l’interférence qui résulte de la présence d’acides aminés et de protéine dans la salive. Le test agit pour empêcher les interférences qui résultent de la mesure de l’absorbance à des longueurs d’onde inadéquates.

Catalase :

La catalase est une enzyme qui fonctionne pour décomposer le peroxyde d’hydrogène en gaz d’oxygène et en molécules d’eau (P.C. Loewen, J. Switala, B.L. Triggs-Raine, 1985). Il est commun de trouver dans la plupart des organismes vivants qui sont exposés à l’oxygène. Lorsque les cellules effectuent des processus métaboliques, le peroxyde d’hydrogène peut être un sous- produit nocif. Les cellules utilisent ensuite la catalase pour accélérer le processus de décomposition du peroxyde d’hydrogène nocif en molécules d’oxygène et d’eau moins dangereuses. La réaction de catalase de la décomposition est:

2𝐻2𝑂2 → 2𝐻2𝑂 + 𝑂2

Il est soluble dans du tampon phosphate de sodium-potassium 50 mM avec un pH de 7,4.

Mesures d’activité enzymatique :

Il faut une très petite quantité d’enzymes pour préparer une solution enzymatique avec l’activité désirée. En outre, les protéines de l’enzyme peuvent être endommagées ou dépliées dans le processus de production d’une solution ou pendant le stockage de l’enzyme. Il est très difficile de peser ces petites quantités nécessaires et l’activité de l’enzyme n’est pas complètement connue.

Cela signifie qu’après avoir fait une solution, l’activité sera un peu incertaine. D’autres méthodes de contrôle de l’activité de la solution enzymatique sont nécessaires. Dans ce projet, la spectrophotométrie est utilisée.

Activité enzymatique :

La quantité d’enzymes peut être exprimée soit en quantités molaires, comme tous les produits chimiques, soit en termes d’activité, en tant qu’unités enzymatiques. La définition de l’activité enzymatique est le nombre de moles de substrat converties par unité de temps. L’unité de mesure de l’activité catalytique est appelée katal.

La définition de katal est; l’activité catalytique qui augmentera la vitesse de réaction d’une mole par seconde dans un système d’analyse spécifié.

Mode opératoire :

L’activité de la catalase a été évaluée en incubant l’échantillon de la salive dans 1,0 ml de substrat (65 umol / ml de peroxyde d’hydrogène dans 60 mmol / l de tampon phosphate de sodium-potassium, pH 7,4) à 37 ° C pendant trois minutes. La réaction a été arrêtée avec du molybdate d’ammonium. L’absorbance du complexe jaune de molybdate et de peroxyde d’hydrogène est mesurée à 374 nm par rapport à le blanc.

Pour effectuer la mesure d’activité il doit être placé dans une cuvette dans la porte- échantillon du spectrophotomètre. Ensuite, l’absorbance est surveillée. Vous trouverez ci-dessous une description détaillée de la préparation des réactifs et de la mesure.

Tampon de phosphate de sodium- potassium :

Ce tampon est préparé en dissolvant 1,06 g de NaH2PO4 et 0,344 g de K2HPO4 dans 100 ml d’eau distillée.

Solution de peroxyde d’hydrogène :

La solution de peroxyde d’hydrogène est constituée de peroxyde d’hydrogène concentré dissous dans le tampon phosphate de sodium-potassium. La solution de peroxyde d’hydrogène est toujours faite juste avant les mesures.

Molybdate d’ammonium (32,4 mmol / l).

Après Avoir décongelé les échantillons salivaires des deux groupes témoins et patients, On va préparer tous les tubes qu’on a besoin pour réaliser l’essai.

Calcul :

La constante de vitesse d’une équation de réaction de premier ordre (k) est utilisée pour déterminer l’activité de la catalase:

L’activité de catalase kU=2.303/t*[logS°/S−M]*Vt/Vs

t: temps.

S°: absorbance du tube standard. S: absorbance du tube test.

M: absorbance du test de contrôle (facteur de correction). Vt: volume total de réactifs dans le tube test.

Vs: volume de sérum.

Le présent test utilise un facteur de correction (contrôle-test) pour exclure l’interférence qui provient de la présence d’acides aminés et de protéines dans l’échantillon qui contient l’enzyme catalase. L’absorbance de l’éprouvette dans la procédure est liée à deux types de composés, le peroxyde d’hydrogène n’ayant pas réagi et les interférences trouvées dans la salive. L’absorbance du tube témoin dans la procédure concerne les composés interférents présents uniquement dans la salive. En soustrayant l’absorbance du tube de contrôle-test de l’absorbance du tube test, nous éliminons l’interférence de tout composé qui réagit avec le molybdate d’ammonium tel que les acides aminés ou les protéines. Cela signifie que l’absorbance restante appartient uniquement au peroxyde d’hydrogène n’ayant pas réagi.

B- Méthode de dosage des protéines carbonylés :

Principe de la méthode :

1990.

Le dosage des protéines carbonylées est déterminé selon la méthode de Levine et al., en

La méthode la plus couramment utilisée consiste à déterminer la teneur en groupements carbonylés des protéines. La méthode conventionnelle est basée sur une méthode colorimétrique qui mesure la formation d’hydrazone après réaction de la dinitrophenylhydrazine avec les groupements carbonylés.

Cependant, cette méthode nécessite de nombreuses étapes de précipitation des protéines par TCA à 20% et éthanol /éthyle acétate. Ensuite, la dissolution de culot protéique dans le guanidine.

La lecture se fait par spectrophotométrie à 360 nm pour calculer les concentrations des protéines carbonylées en utilisant le coefficient d’extinction (ε = 21,5 mmol-1. l. cm-1).

Protocole de dosage :

• La mesure est réalisée par le dosage des dérivés carbonylés selon la méthode de Levine et al., (1990).
• 100 µl d’échantillon sont déposés dans deux tubes .Dans un tube 500 µl de HCl 2,5M (blanc d’échantillon) sont rajoutés et dans l’autre tube 500 µl de dinitrophénylhydrasine DNPH 10Mm (échantillon) sont rajoutés.
• Les échantillons sont placés à l’obscurité, pendant 1 heure à température ambiante. Une agitation est effectuée toutes les 10-15 min.
• 500 µl d’acide Trichloroacetique à 20% sont additionnés, le mélange est vortexé puis centrifugé à 10.000 g pendant 5 min à 20°C.
• Le surnageant est éliminé et le culot est lavé 3 fois avec 1 ml d’un mélange d’éthanol et d’acétate d’éthyle (1 :1, v : v) et le surnageant est éliminé à chaque lavage.
• Les protéines précipitées sont redissoutes dans 0,6ml de guanidine et la solution est incubée 15 min, 37°C.
• Une centrifugation à 10000 g durant 15 min permet d’éliminer les débris insolubles.
• Un spectre d’absorption est réalisé en 360 nm pour obtenir les dérivés aldéhydes et les cétones.
• La concentration de ces derniers est calculée par différence d’absorbance entre le blanc et l’échantillon selon la formule suivante : C= absorbance / Ɛ Ɛ=22000/〖10〗^6 nmol/ml pour de 360 nm). (Ɛ : coefficient d’extinction molaire spécifique à la longueur d’onde choisie).

Calcul des résultats :

Le coefficient d’extinction (ε) pour la dinitrophénylhydrazine à 360 nm est de 22 000 M- 1cm-1. Quand l’absorbance de l’échantillon est lue à 360 nm contre son blanc, la teneur en protéine carbonylée est calculée :

• Protéine carbonylée (M) = A360 nm / 22 000 M-1 (lorsqu’une cuvette de 1 cm de largeur est utilisée)
• Protéine Carbonyle (nmol / ml) = A360 nm x 45,45 (nmol / ml)
• Protéine Carbonyle (nmol / mg) = Protéine Carbonyle (nmol / mL) / Concentration en protéines (mg / mL).

5- Analyse statistique :

Les résultats sont exprimés sous forme moyenne ± Écart type.

La comparaison des moyennes entre les échantillons témoins et les échantillons patients est effectuée par le test «t» de student après analyse de variance.

• Résultat significative si p<0.05 (*).
• Résultat hautement significative si p<0.01 (**).
• Résultat très hautement significative si p<0.001(***).
• Résultat non significative si p>0.05.