Quelles Applications Pratiques des Zones Humides en 2023 ?

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Cette étude révèle les applications pratiques des zones humides en analysant les aspects éco-bactériologiques et enzymatiques des sites Ramsar d’Oran et de Bechar. Découvrez comment ces résultats peuvent transformer notre compréhension de la biodiversité et de la conservation environnementale.

1. Antibiogramme :

La méthode utilisée est celle de la diffusion en milieu gélosé , cette méthode simple permet la détermination de la sensibilité des souches vis-à-vis des antibiotiques à tester (fiche technique antibiogramme, 1995).

La figure 32 montre la technique de l’antibiogramme.

• 1. Milieu utilisé :

Géloses Muller Hinton (MH), coulées en boîtes de Pétri sur une épaisseur de 4mm. (Les géloses sont séchées avant emploi).

• 1. Inoculum: (Rahal ,2005)
• A partir d’une culture pure de 18 heures sur milieu d’isolement, racler à l’aide d’une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques.
• décharger l’anse dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile à 0,9%.
• bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland (illustré dans le control de l’inoculum) ou à une DO de 0,8 à 0,10 lue à 625nm.
• L’inoculum peut être ajusté en ajoutant soit de la culture s’il est trop faible, ou bien de l’eau physiologique stérile s’il est trop fort.
• L’ensemencement doit se faire dans les 15 minutes qui suive la préparation de l’inoculum.
  1. Contrôle de l’inoculum (Rahal ,2005) :
• Préparer l’étalon 0,5 Mc Farland, en versant 0, 5 ml d’une solution de BaCl₂ hydraté à 1% (10 g/l) dans une éprouvette de l00ml. Compléter a 100 ml avec du H₂S04 à 1% (10 ml/l) Ainsi préparé il doit avoir une DO de 0,08 a 0,1 lue à 625 nm.
• Aliquoter la solution en volumes de 10ml, dans des tubes identiques a ceux qui serviront à la préparation des inoculums (le nombre d’aliquots sera fonction du nombre de manipulateurs).
• Sceller ces tubes de façon à éviter toute évaporation (para film, ruban adhésif,).
• Repérer le niveau du liquide à l’aide d’un marqueur, et le contrôler régulièrement en prenant la densité optique.
• Conserver les tubes à température ambiante et à l’abri de la lumière (papier aluminium).
• Homogénéiser le tube étalon avant de le comparer à l’inoculum préparé: Inoculum et étalon doivent avoir la même turbidité lorsqu’ils sont examinés sur un fond rayé.
  1. Ensemencement : (Rahal ,2005)
• Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne.
• L’essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum.
• frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées.
• répéter l’opération deux fois, en tournant la boîte de 60°C à chaque fois sans oublier de faire pivoter l’écouvillon sur lui –même et finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la périphérie de la gélose.
  1. Application des disques d’antibiotiques : (Rahal ,2005)
• Nous avons utilisé un distributeur de disque à raison de 6 disques d’antibiotique par boite de Pétri.
• Les listes d’antibiotiques recommandés pour le test de sensibilité des Entérobactériaceae Bacillaceae et Pseudomonaceae sont reportées dans la page suivante ( page 129) un autre tableau plus détaillé pour les antibiotiques spécifiques d’enterobacteriaceae est en parie annexe 3.
• Incuber à 37°C pendant 18 à 24 heurs.

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Anse de platine Ecouvillon

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(2)

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Disques d’antibiotique

Distributeur de disques d’antibiotiques

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Incubation à 37C° pendant 18 à 24 h

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Figure 32 : Technique de l’antibiogramme selon (Rahal,2005).

Tableau 18 : Les principaux antibiotiques utilisées pour la famille des Enterobactereaceae (Jean et Guy, 1988) et (Louis, 2011)

Tableau 19 : Les principaux antibiotiques utilisées pour la famille des Bacillaceae (Louis, 2011)

Tableau 20 : Les principaux antibiotiques utilisées pour la famille des Pseudomonaceae (Louis, 2011)

1. Contenu plasmidique :

10 .1.Extraction d’ADN plasmidique à partir des souches bactériennes :

Une mini préparation plasmidique des souches puissantes (qui se sont montrées plus actives en antibiorésistance) a été faite selon la méthode de (Zaghloul et al, 1985) avec de légères modifications comme suite :

1. /-Préparation bactériennes : (Voir Figure 33)

10ml de milieu LB est inoculé par une colonie des bactéries et incubé pendant 24heures à 37°C sous agitation :

Récupération et lavage des cellules :

• • Prélever 1.5 ml de suspension bactérienne placée en éppendorfs stériles.
  • Centrifuger à 12000 tr/min pendant 10 min
  • Eliminer le surnageant
  • Ajouter 1.5 ml de suspension bactérienne
  • Centrifuger à 12000 tr/min pendant 10min
  • Eliminer le surnageant
  • Remettre le culot en suspension dans 1 ml de tampon Tris 50 Mm, EDTA 50Mm, 20%saccharose.
  • Centrifuger à 12000 tr/min pendant 10min
  • Remettre le culot en suspension dans 200 µl de tampon Tris 50Mm, EDTA 10Mm

1. /-Lyse lytique (dénaturation alcaline) :

Ajouter 200ul de mélange lytique (0.2 M NAOH, 1% SDS) puis mélangé sans vortex jusqu’à ce que la solution devienne claire et visqueuse.

1. /-Purification de l’ADN plasmidique :

Placer les éppendorfs dans la glace et ajouter 143 µl d’acétate de sodium 3M, pH=5.2 pour réaliser la précipitation d’ADN chromosomique dénaturé par la soude et les protéines complexes par le SDS (détergent) et mélanger par retournement (selon un mouvement de va et viens vertical) successifs de 6 à 10 fois et le laisser pendant 10min.

• • Centrifuger à 12000 tr/min à une T° ambiante.
  • Récupérer le surnageant volume V
  • Ajouter V iso propanol absolu à -20C° et placer à-20C° pendant 30 minutes pour précipiter l’ADN plasmidique.
  • Centrifuger à 14000 tr/min pendant 15 min
  • Eliminer le surnageant
  • Remettre le culot en suspension dans 300 µl d’éthanol à 75%, centrifugé à 14000 tr/min pendant 15 min.
  • Eliminer le surnageant
  • Sécher le culot quelques minutes à 37°C pour éliminer l’éthanol
  • Mettre 300 µl TE dans le culot qui est déjà préparé.

9.2. Electrophorèse sur gel d’agarose :

1. /-Préparation du gel d’agarose à 1%:
   • Peser la quantité d’agarose nécessaire pour confectionner un gel à 1%(P/V) sachant que le volume final du gel sera 75ml.
   • Transférer la poudre d’agarose dans un erlenmeyer et ajouter 75ml de TBE 1X mesuré à l’éprouvette.
   • Porter à l’ébullition au bec benzène jusqu’à ce que tous l’agarose soit fondu .
   • Laisser tiédir (on doit pouvoir tenir l’erlenmeyer dans sa main sans se faire bruler et rajouter 0,5ml de BET.
   • Couler sur le support horizontal et mettre le peigne.
   • Laisser l’agarose se refroidir et solidifier.
2. /-Identification de l’ADN plasmidique : (Voir Figure 34)
3. la mise en électrophorèse :
   • Après incubation, ajouter 500 µl du tampon de charge à chaque éppendorfs
   • Placer le gel dans la cuve avec du tampon TBE X 01 (le gel doit être légèrement submergé) la longueur du gel est d’environ 80 mm (8cm) et d’une largeur 50 mm (5cm).
   • Déposer les échantillons.
   • Fermer le couvercle de la cuve à électrophorèse et faire migrer à17-50-80 V.
4. Analyse du profil électro phorétiques :
   • Arrêter la migration en coupant le courant lorsque le colorant (bleu de bromothymol) du tampon de charge a suffisamment migré
   • Prendre une photo du gel sous le rayonnement UV

NB : l’ADN plasmidique migre le premier à cause de sa légèreté , il parait sous forme de taches moins fluorescente sur le gel d’agarose que l’ADN chromosomique.

• • L’évaluation des tailles de fragments d’ADN plasmidiques migrés sur le gel d’agarose ce fait selon une approche comparative citée par (Sarlin, 2008) consiste à l’estimation approximative de l’intensité de coloration (bromure d’éthidium) d’une bande d’acides nucléiques comparativement à une bande de référence dont on connait préalablement la quantité on peut déduire la taille d’un fragment à partir du graphe Log (taille) = F(distance parcourue) de se fait et selon (Medraoui, 2010) un gel de concentration avoisinante de 0,9% permet la séparation des fractions d’ADN d’une gamme de 0,5 à 7 Kb, les distances parcourues par les fragments d’ADN est inversement proportionnelle aux Logarithme des tailles il suffit donc de reporter les coordonnées,abscisses sur graphe pour déduire par la suite les tailles obtenues sur gel d’agarose (Voir Figure 35 ,36 et Tableau 21).

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Figure 33: Protocole d’extraction plasmidique à partir des bactéries selon (Zaghloul et al, 1985).

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Figure 34 : Protocole d’électrophorèse selon (Zaghloul et al, 1985).

Ex : standard ADN gene ruler 1Kb de Fermentas

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Gene Ruler™ 1kb DNA Ladder

1.0% agarose

1.0% agarose 0.5μg/lane,

8cm length gel, 1X TAE, 17V/cm

Figure 35 : Evaluation de la taille des fragments d’ADN plasmidique avec comparaison à un marqueur de taille Gene Ruler™ 1kb DNA Ladder selon (Sarlin, 2008).

Tableau 21 : Déduction des tailles des fragments d’ADN plasmidiques à travers le graphe Log (taille)= F(D) selon l’approche de (Sarlin, 2008).

Log arithme de taille

Figure 36 : Déduction de la taille des fragments d’ADN plasmidiques à partir du graphe Log taille=F (distances parcourues) selon (Sarlin, 2008).

F(Distances parcourues)

72

65

60

55

49

45

1

0,5

0

Log taille =f(distance)

3,5

3

2,5

2

1,5

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