Analyse Révolutionnaire de l’Antibiorésistance des Entérobactéries à Sétif : Quels Gènes Dominent ?

Cette étude révèle comment l’antibiorésistance des entérobactéries à l’Hôpital de Sétif est dominée par les gènes CTX-M. Découvrez les implications cruciales de ces résultats pour la lutte contre les infections bactériennes et la santé publique.

Ce mémoire évalue la résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées à l’Hôpital de Sétif, en se concentrant sur les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) et leur caractérisation génétique par PCR-Multiplex. Les résultats montrent une prévalence élevée de résistance aux β-lactamines, avec une dominance des gènes CTX-M.

Université Ferhat Abbas Sétif

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de microbiologie

Master en biologie

Filière: Biologie

Spécialité: Microbiologie appliquée

Mémoire

Antibiorésistance des entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu isolées de l’Hôpital de Sétif : détermination des gènes par PCR-Multiplex

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Refoufi Khalil Abdallah

Dirigé par: Dr. Silini-Cherif Hasfa & Pr. Sahli Farida

2016/2017

Sommaire

Listes de tableaux

Listes des figures

Liste des abréviations

Résumé

Introduction 1

Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

1. Les entérobactéries 3
   1. Définition 3
   2. Classification 3
   3. Caractères bactériologiques 3
   4. Caractères biochimiques 4
   5. Caractères antigéniques 4
   6. Pouvoir pathogène 4
2. Les β-lactamines 7
   1. Classification des β-lactamines 7
      1. Les pénicillines (noyau péname) 8
      2. Les céphalosporines (noyau céphème) 8
      3. Les pénèmes (carbapénèmes) 10
      4. Les monobactames 10
      5. Les inhibiteurs des β-lactamases 10
   2. Mode d’action des β-lactamines 12
3. Résistance des entérobactéries aux β-lactamines 12
   1. Types de résistance 12
      1. La résistance naturelle 13
      2. La résistance acquise 13
   2. Supports génétiques de la résistance 14
      1. Le chromosome 14
      2. Les éléments génétiques mobiles 14
4. Plasmides 15
5. Séquences d’insertion et transposons 16
6. Les intégrons 16
   1. Mécanismes de résistance aux β-lactamines 17
      1. Diminution de la perméabilité 17
      2. Modification de la cible 17
      3. Hyperproduction du système d’efflux 17
      4. Production d’enzymes 18
7. Les β-lactamases 18
   1. Classification des β-lactamases 19
      1. Classification d’Ambler 19
      2. Classification de Bush-Jacoby-Medeiros 20
8. Les β-lactamases à spectre élargi BLSE 22
   1. Différents types de BLSE 22
      1. BLSE de type TEM (Temoneira – nom du patient) 22
      2. BLSE de type SHV : (Sulfhydryl variable) 24
      3. BLSE de type CTX-M (Cefotaximase-Munich) 25
      4. Autres types de BLSE 25
      5. Les carbapénèmases 26
9. Épidémiologie mondiale des entérobactéries BLSE 29
   1. Les BLSE classiques 29
      1. En Europe 29
      2. En Afrique 29
      3. En Asie 30
      4. En Amérique 31
   2. Les BLSE de type carbapénèmases 32
10. Facteurs de risque d’acquérir une BLSE 33

Chapitre 2 : Matériel et méthodes

1. Prélèvement et identification 34
   1. La mini galerie (galerie classique) 34
   2. La galerie Api 20^E 35
   3. Le système MicroScan WalkAways SIEMENS 35
2. Antibiogramme 36
3. Détection phénotypique des EBLSE 37
   1. Test de synergie 38
   2. Test du double disque 38
   3. Test à la cloxacilline 39
4. Détection génotypique des EBLSE 40
   1. Extraction d’ADN plasmidique par la lyse alcaline 40
5. Extraction d’ADN 40
6. Extraction de l’ADN chromosomique par boiling 41
   1. Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) 41
      1. Principe 41
   2. Électrophorèse sur gel d’agarose 43

Chapitre 3 : Résultats et discussion

Résultats 44

1. Entérobactéries 44
   1. Répartition des entérobactéries par espèces 44
   2. Répartition des entérobactéries selon l’origine de l’infection 45
   3. Pourcentage des entérobactéries selon le sexe 45
   4. Répartition des entérobactéries selon les tranches d’âge 46
   5. Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques 47
   6. Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques par année 47
2. Résistance aux β-lactamines 47
3. Résistance aux autres antibiotiques 48
4. Les EBLSE 49
   1. Fréquence d’isolement des EBLSE 49
   2. Répartition des EBLSE selon l’espèce 50
   3. Répartition des EBLSE selon l’origine de l’infection 50
   4. Répartition des EBLSE selon le service 51
   5. Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement 52
   6. Répartition des EBLSE selon le sexe 52
   7. Profil de résistance des EBLSE 53
      1. Résistance aux β-lactamines 53
      2. Résistance aux aminosides 54
      3. Résistance aux quinolones 54
      4. Résistance aux autres antibiotiques 54
5. Support génétique de la résistance 55
6. Caractérisation des BLSE par la PCR-multiplex 58
   1. BLSE de type CTX-M 58
   2. BLSE de type SHV 60
   3. BLSE de type TEM 60
   4. Résistances multiples 60

Discussion 63

Conclusions et perspectives 69

Références bibliographiques 72

Annexe

Résumé

L’évaluation de la résistance aux antibiotiques des entérobactéries provenant de malades externes ou hospitalisés dans les différents services du CHU de Sétif, durant la période de Janvier 2013 à Avril 2017 porte sur les données du logiciel de sauvegarde «Whonet 5.6 » utilisé au laboratoire.2421 souches d’entérobactéries isolées sont identifiées. E. coli est la souche la plus fréquente (n= 1160), suivie par K. pneumoniae (n=479) et P.mirabilis (n=216). Ces souches proviennent majoritairement du milieu hospitalier (57.71 %) et semblent coloniser les adultes plutôt que les enfants où le sexe féminin représente un facteur de risque. Le profil de résistance de ces entérobactéries atteste d’un taux très élevé de résistance aux bêtalactamines.

Les valeurs maximales sont notées pour l’amoxiclline où 98.40% des souches sont résistantes et les plus faibles résistances sont notées pour les carbapénèmes (l’imipénème et l’ertapénème) et la cefoxitine. Les 56 entérobactéries productrices de BLSE isolées durant l’année 2017 représentent 35% de la totalité des entérobactéries isolées pendant cette période. Elles sont réparties comme suit : 23 E. coli, 22 K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes et 1 C. freundii. Elles sont plutôt issues d’infections nosocomiales (75%) que communautaires (25%). Les services les plus concernés sont l’infectieux et la néphrologie et les prélèvements les plus incriminés sont les urines et le pus.

Ces souches EBLSE ont des résistances très élevées (100%) à la majorité des β-lactamines (AMX, AMP, TIC, C3G, C4G et l’aztréonam). Alors que l’IMP, ERT, MER, AMK et FOS restent les antibiotiques les plus actifs. Le profil plasmidique des souches EBLSE confirme qu’elles peuvent héberger de 1 à 4 types de plasmides. La caractérisation des gènes des BLSE effectuée sur l’ADN (plasmidique ou chromosomique) de 33 souchespar l’amplification multiple des gènes (CTX-M, TEM et SHV) a permis l’obtention d’une prévalence de CTX-M (87.87%) suivie de SHV (42.42%) et de TEM (27.27%). Toutefois, cinq souches K. pneumoniae (n=4) et E. aerogenes (n=1) semblent porter les 3 gènes de résistance en même temps, indiquant la gravité de ce phénomène.

Abstract

The evaluation of the resistance to the enterobacteria resulting from external patients or hospitalized in the different services of Setif CHU, from January 2013 to April 2017. Carried out on the data of the saveguard software «Whonet 5, 6», utilized at laboratory. 2421 isolated strains of enterobacteria are identified. E.coli the most frequent strain (n = 1160), followed by K.pneumonia (n=479) and P.mirabilis (n=216). Theses strains usually come from the hospital milieu (57.71%) and seem to attain adults rather than children where the feminine sex represents a risk factor. The resistance profile of theses enterobacteria manifests a higher rate of resistance to beta- lactamines. The maximal values are noted for amoxicilline where (98.40%) of the strains are resistant and the weakest resistance is noted for the carbapenemes (imipenemes and ertapenemes) and the cefoxitine. The 56 enterobacteria which produces BLSE isolated along the year 2017 represent 35% of the whole: 23 E. coli, 22 enterobacteria previously isolated during this period. They are divided as follows: K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes and 1 C. freundii. They are the outcome of nosocomial infections (75%) rather than communitory (25%).The mostly concerned services are the infection and the nephrology services and the most requested samples are the urines and the puss.

Theses EBLSE strains possess a higher resistance (100%) to the majority of B-lactamines (AMX, AMP, TIC, C3G, C4G and aztreonam). While IMP, ERT, MER, AMK and FOS remain the most active antibiotics. The plasmidic profile of the EBLSE strains confirms that they can host from 1 to 4 types of plasmids. The EBLSE genes characterization carried out on DNA (plasmidic or chromosomic) of 33 strains via the multiple amplification of the genes (CTX-M, TEM and SHV) allowed the obtainment of a prevalence of CTX-M (87.87%) followed by SHV (42.42%) and by TEM (27.27%). However, five strains K. pneumonia (n=4) and E. aerogenes (n=1) seem to carry 3 genes of resistance at the same time, a factor that clearly indicates the seriousness of this phenomenon.

Introduction

Depuis la découvert des antibiotiques en 1928 par Alexander Fleming et dés leur utilisation durant la seconde guerre mondiale, les antibiotiques de la famille des β-lactamines ont été confrontés à l’émergence de la résistance. Cependant, la résistance bactérienne aux antibiotiques est en perpétuelle évolution. Cette résistance est la résultante d’interactions complexes entre la bactérie d’une part et son environnement d’autre part. Elle est liée essentiellement à un usage excessif des antibiotiques aussi bien en médecine humaine, qu’en médecine vétérinaire ou dans l’alimentation animale (Bradford. 2001b). Les bactéries, pour faire face à la pression de sélection exercée par les antibiotiques utilisent des parades leur permettant de s’adapter aux conditions hostiles de leur environnement (Benredjeb et al. 2000).

Selon le rapport de l’OMS en 2014, sur la surveillance mondiale de la résistance aux antimicrobiens, la résistance aux antibiotiques est une réalité existant partout dans le monde et constitue désormais une grave menace pour la santé publique (Anonyme. 2014). En effet, on assiste à l’émergence et à la dissémination des bactéries multirésistantes par hyperproduction de céphalosporinase (AmpC) ou production de bêtalactamases à spectre élargi (BLSE) ou encore de carbapénémases.

Jusque dans les années 2000, la diffusion des entérobactéries productrices de BLSE concernait essentiellement le milieu hospitalier, de nombreuses épidémies hospitalières en réanimation ou en hospitalisation de longs séjours ayant été décrites. Mais aujourd’hui, la diffusion à grande échelle dans le domaine communautaire de ce type de résistance laisse augurer un problème majeur de santé publique. Les infections causées par les souches productrices de BLSE sont associées à une morbidité et une mortalité élevées, à une prolongation de la durée de l’hospitalisation et à une augmentation des coûts d’hospitalisation.

Découvertes au début des années 1980, les BLSE sont une grande famille d’enzymes bactériens capables d’hydrolyser les pénicillines, les quatre générations de céphalosporines et l’aztréonam. Elles n’hydrolysent pas les carbapénèmes ni les céphamides. Elles sont retrouvées essentiellement dans la famille des entérobactéries, principalement Escherichia coli et Klebsiella spp. (Bradford, 2001a).

La plupart des BLSE détectées auparavant étaient les types classiques TEM et SHV qui diffusaient majoritairement chez des souches de Klebsiella pneumoniae et d’Enterobacter spp étroitement associés à des infections nosocomiales. Actuellement, un nouveau type d’enzyme, le CTX-M dissémine au sein des souches communautaires. Les gènes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA ont été décrits dans plusieurs études épidémiologiques. La résistance bactérienne par production de BLSE est devenue un problème de santé publique mondiale car compromettant gravement les thérapies antimicrobiennes.

De ce fait, le but de ce travail est l’évaluation de la résistance aux β-lactamines, des souches d’entérobactéries d’isolement courant dans le CHU de Sétif, afin de déterminer la fréquence de résistance aux céphalosporines de 3éme génération et des résistances associées au sein des espèces. Par la suite, une caractérisation par la technique moléculaire (PCR) des β-lactamases dessouches d’entérobactéries productrices pour mettre en évidence le degré de leur diversité génétique.