Les milieux sélectifs en microbiologie sont essentiels pour isoler des souches bactériennes dans les zones humides classées Ramsar. Cette étude identifie 35 souches, évalue leur résistance aux antibiotiques et analyse leur contenu plasmidique, contribuant à la compréhension de la biodiversité microbienne dans ces écosystèmes.
Les milieux sélectifs : Composition chimique (voir Annexe)
Ces milieux sont rendus plus sélectifs par addition d’antibiotiques, acides aminés, sucres, colorant, Les caractéristiques, composition chimique préparation, mode d’ensemencement et principe ainsi la lecture des résultats de ces milieux seront représentées respectivement sous dessous (gélose Chapman, gélose SS, gélose Mosel, gélose nutritive AB, gélose King A et gélose King B, gélose M17, gélose VFS,gélose MRS)
Milieu Chapman :
Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négative (Guillaume, 2004)
Germe recherché : Staphylococcus, Micrococcus……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre en suspension le milieu déshydraté de la forme commercialisé dans 1 litre d’eau distillée, porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, ajuster le PH et répartir en tubes ou en flacons, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes (Haho, 2010).
Faire fondre le milieu , refroidir et maintenir à 44°C, couler en boîtes de Pétri stériles, laisser solidifier sur une surface froide, faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert, transférer 0,1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales dans les boîtes de Pétri, étaler l’inoculum à la surface du milieu à l’aide d’un étaleur stérile, incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures (Haho, 2010).
Mode d’ensemencement et principe :
L’ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation. Ne pas sécher le milieu à l’étuve avant l’ensemencement : la déssication du milieu pourrait entraîner une augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop inhibiteur, ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L-1), ce qui permet un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en Na Cl, on peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré du rouge de phénol autour des colonies (Guillaume, 2004).
La forte concentration en chlorure de sodium inhibe la croissance de la plupart des bactéries autres que les staphylocoques, la fermentation du mannitol, mise en évidence par le virage au jaune de l’indicateur pH (rouge de phénol), permet d’orienter le diagnostic (Haho, 2010.)
Lecture des résultats :
L’utilisation du mannitol se traduira par une acidification du milieu, provoquant le virage au jaune de l’indicateur de pH ,les colonies mannitol+ sont entourées d’une aérole jaune, l’utilisation du mannitol est un caractère discriminatif important dans le genre Staphylococcus, Staphylococcus.aureus étant mannitol+, ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré ainsi des colonies pigmentées au jaune et mannitol+ : forte suspicion de S.aureus (Guillaume, 2004), les autres espèces de Staphylocoques donnent généralement des colonies plus petites, rosées et n’entraînent pas de virage du milieu ainsi d’autres microorganismes sont fréquemment rencontrés sur ce milieu : Micrococcus (colonies brunâtres à noirâtres), Bacillus (colonies brun mat).
Remarque : Le milieu Chapman permet la sélection des Staphylococcus et une orientation par l’identification de l’espèce S.aureus, mais il ne s’agit que d’un test de présomption et une confirmation par tests plus spécifique (coagulase, ADN ase…) reste obligatoire. (Guillaume, 2004)
Milieu Gélose SS :
Gélose Salmonella–Shigella est un milieu sélectif permettant l’isolement d’entérobactérie, il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles peu pour les Shiguella car trop sélectif ceci se fait après enrichissement préalable. (Guillaume, 2004)
Germe recherché : Salmonella, Shiguella, Citrobacter……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Mettre en suspension 63,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée, porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, ajuster le PH, ne pas autoclaver (Haho, 2009).
Refroidir et maintenir le milieu à 44 °C, couler en boîtes de Pétri stériles, laisser solidifier sur une surface froide, faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert, ensemencer en stries l’inoculum à partir des milieux d’enrichissement utilisés, incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures (Haho, 2009).
Le mode d’ensemencement et principe :
Isolement par la méthode des cadrans incuber de 18 à 24h à 37°C,ce milieu contient des inhibiteurs comme les sels biliaires ,du vert brillant et une forte concentration en citrate de sodium ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries gram+positive et rendent difficile la croissance des bactéries gram-négative autres que salmonella et Shiguella ,le milieu contient du lactose pouvant être fermenté et le thiosulfate pouvant donner du H2S (Guillaume, 2004).
Lecture des résultats :
Des colonies rouges de lactose +et des colonies incolores de lactose –et des colonies à centre noir à H2S+ (Guillaume, 2004).
Les Salmonella qui ne fermentent pas le lactose présentent des colonies incolores, transparentes, avec ou sans centre noir (production d’H2S) (Haho, 2009).
Les Shiguella sont incolores et les coliformes présentent des colonies rouges ou rosées (Haho, 2009).
Gélose Mosel :
Milieu sélectif utilisé pour l’isolement de Bacillus .cereus selon (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Bacillus……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Mettre en suspension 44,5g du milieu déshydraté dans 0,9 litre d’eau distillée, porter lentement à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, faire répartir en flacons, à raison de 90 ml par flacon, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes, pour l’usage faire fondre le milieu refroidir et maintenir à 44°C dans un bain marie chaque flacon de 90 ml de milieu de base on a lui a ajouté 10 ml d’émulsion stérile de jaune d’œuf et
1 ml de supplément sélectif la Poly myxine fournit en ampoule, homogénéiser parfaitement et faire couler en boîtes de Pétri stériles et laisser solidifier sur une surface froide après faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert selon les recommandations de (Mosel et al, 1967).
Mode d’ensemencement et principe :
Transférer 0,1 ml de l’échantillon d’eau à analyser et étaler l’inoculum en surface stérilement et l’incuber à 30°C pendant 24 et 48 heures selon les recommandations de (Mosel et al, 1967), en principe la polymexine inhibe et retard la croissance des autres germes, le tryptone et l’extrait de levure favorisent la croissance des Bacillus.cereus, le jaune d’œuf additionné après autoclavage contient de la lécithine permettant la mise en évidence des lécithinases caractérisant l’espèce Bacillus.cereus finalement le mannitol +positive qui se traduit par le virage de l’indicateur coloré du rouge de phénol en jaune permettant la différenciation des bactéries contaminants le milieu des Bacillus.cereus qui sont dites mannitol – négative.
Lecture des Résultats : s’il y a croissance alors présence de la souche Bacillus cereus les caractères typiques de la colonie sont les suivant :
Le rose rouge veut dire mannitol négatif alors que l’halo blanchâtre au centre de la colonie est un signe de lécithinase positive (Guillaume, 2004).
Procéder à la sélection et à la purification des colonies douteuses pour confirmation par des études biochimiques appropriées (Mosel et al, 1967).
Pour une éventuelle confirmation du Bacillus.sp les colonies suspectes subissent une coloration de gram et une coloration de la spore (Delarras, 2007).
Milieu King A et King B:
Le milieu King A et B ont été décrit par King, Ward et Raney en 1954 puis leur formule a été modifiée selon les recommandations de la pharmacopée américaine (King et al, 1954).
Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différentes espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Pseudomonas.f et Pseudomonas.aeruginosa……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Pour le King A : 45g de poudre par litre ; stérilisation classique ; ajouter 10 ml de glycérol après autoclavage.
Pour le King B : 37g de poudre par litre ; stérilisation classique ; ajouter 10 ml de glycérol après autoclavage.
A partir de chaque colonie suspecte prélevée sur le milieu d’isolement sélectif, puis purifiée sur gélose nutritive, ensemencer la surface inclinée de gélose King B et King A par des stries serrées. Il est nécessaire d’utiliser des cultures pures prélevées au centre de colonies bien isolées, si non les réactions croisées rendent l’identification impossible à réaliser puis incuber à (36)°C pendant 24 heures et jusqu’à 5 jours, capsules desserrées, de manière à favoriser les échanges gazeux.
Mode d’ensemencement et principe :
Ensemencer les deux milieux: King A et King B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose. Fermer les tubes sans serrer et incuber à 30°C pendant 1 à 4 jours (Delarras, 1998).
L’élaboration des pigments est influencée par la composition du milieu, ce qui justifie l’utilisation de deux milieux différents (Guillaume, 2004).
- La production de pyocyanine, due spécifiquement à Pseudomonas aeruginosa, est favorisée par la présence d’ions inorganiques et de certains acides aminés qui composent le milieu King A (Noëmie, 2011).
- La production de pyoverdine, caractéristique du groupe fluorescent, dépend de la nature des peptones, et favorisée par la teneur élevée en phosphate présents dans le milieu King B (Noëmie, 2011).
Lecture des Résultats :
La présence de pigments diffusibles se traduit par l’apparition d’une couleur qui peut diffuser sur toute la pente (Guillaume, 2004)
Sur le milieu King A : les colonies typiques sur ce milieu sont colorées en bleu-vert, parfois en brun-rose (pyorubine). La pyocyanine est extraite par le chloroforme, verser 0.5 ml de chloroforme sur la culture, laissé la 10 à 15 min, en position inclinée : la pyocyanine très soluble dans le chloroforme, le colore en bleu (Ould Brahim ,1998 et Noëmie, 2011).
Sur le milieu King B : la production de pyoverdine se manifeste par une coloration jaune- verte, avec une fluorescence observée au UV à 340 nm ; ce pigment est insoluble dans le chloroforme (Noëmie, 2011).
Croissance à 41°C et 4°C :
Ensemencer une colonie sur deux tubes de gélose nutritive ; incuber l’un de ces tubes à 41°C, l’autre à 4°C ; procéder à la lecture après 24 à 48 heures (Rodier et al, 1996).
Pseudomonas aeruginosa peut se développer à 41°C, mais non à 4°C.