Les enzymes cellulolytiques en Algérie jouent un rôle crucial dans l’hydrolyse de la cellulose, essentielle pour la production de sucres fermentescibles. Cette étude éco-bactériologique dans les zones humides classées Ramsar d’Oran et de Bechar met en lumière l’activité enzymatique de 35 souches bactériennes isolées.
Les enzymes cellulolytique :
Les cellulases sont des enzymes inductibles qui sont synthétisées par des micro-organismes au cours de leur croissance sur matières cellulosiques (Lee et Koo, 2001) et L’hydrolyse enzymatique complète des matériaux cellulosiques à besoins de différents types de cellulases L’hydrolyse de la cellulose par ces enzymes est souvent la voie préconisée pour l’obtention des sucres fermentescibles en industrie (Ballerini, 2006).
La cellulose :
La cellulose est le composé organique le plus abondant dans la nature .On évalue de 60 à 90 milliards de tonnes par an la quantité de cellulose produite par les végétaux terrestre .La cellulose est polymère linéaire de résidu B-D-glucopyranose associés par des liaisons B (1,4),Le degré de polymérisation (DP) est compris entre 2000 et 6000 dans la paroi primaire et il peut être supérieur à 15 000 dans la paroi secondaire .La présence de nombreux groupes OH permet la formation de nombreuses liaisons H
intra et inter-chaines (ces liaisons font intervenir les OH des C2, C3 et C6 et l’oxygène hémiacétalique).La cellulose est insoluble dans l’eau et dans la pluparts des solvants ; elles est aussi très résistante à l’attaque enzymatique. La cellulose n’est pas une source importante de glucose .En effet contrairement à l’amidon qui se trouve sous une forme relativement pure dans la plante, la cellulose est associé à d’autres polyosides ; il faut plusieurs enzymes pour attaquer ce complexe et le procédé est couteux.
L’hydrolyse de la cellulose fournit du glucose éventuellement associé à d’autres oses provenant des autres polyosides accompagnant la cellulose .L’hydrolysat peut être utilisé pour obtenir du glucose purifié ou comme milieu de culture pour micro- organismes et production d’alcools ou de biomasse. Parmi les substances cellulolytique on citera : la viscose, esters de cellulose, Méthylcellulose (MC) et Carboxyméthylcellulose(CMC) selon (Wilson 2008).
La cellulose est un polymère linéaire de glucoses liés par des liaisons de type β-1,4 (voir Figure16 et 17) Ce substrat est très récalcitrant à la dégradation du fait de sa structure compacte. Les molécules sont associées entre elles par l’intermédiaire de liaisons hydrogène pour constituer de véritables réseaux cristallins aux seins de microfibrilles de cellulose selon (Wilson 2008).
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Figure 16 : structure fibreuse de la cellulose (Profweb, 2012).
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a-Structure de la cellulose (Cheba, 2011).
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b-Structure moléculaire de la cellulose (University of Cambridge, 2012).
Figure 17 : Vue sur la structure Linéaire (a) et moléculaire de la cellulose (b).
Les type de cellulases :
Dans la nature, la biodégradation de la cellulose est essentiellement réalisée par des micro- organismes (bactéries et champignons) et elle a lieu aussi bien en aérobiose (par exemple à la surface du sol ou l’eau) qu’en anaérobiose, les cellulases ont d’abord été classées selon leur mode d’action catalytique et sont par la suite classées selon leur structure, comme toutes les enzymes agissant sur les sucres (Ballerini, 2006).
Les différentes enzymes cellulolytiques d’origine microbiens se résume comme suite :
- Endocellulases: elles cassent la structure cristalline de la cellulose en chaînes polysaccharidiques.
- Exocellulases (cellobiohydrolases, ‘CBH’): elles coupent 2-4 unités aux terminaisons des chaînes polysaccharides, libérant par exemple le cellobiose. Elles travaillent progressivement soit depuis la terminaison réductrice, soit depuis l’autre.
- β-glucosidase (Cellobiase): elles hydrolysent les chaînes polysaccharidiques en monosaccharides.
- Cellulases oxydatives: elles dépolymérisent la cellulose
- Cellulose phosphorylases: elles dépolymérisent la cellulose en utilisant des phosphates. Ces cellulases produisent typiquement le β-glucose (Blouzard et al 2010).
Mécanisme de l’hydrolyse de la cellulose :
L’hydrolyse de la cellulose a besoin d’une opération synergique et séquentielle due à la nature complexe de la cellulose. Le système typique inclus trois types d’enzymes : l’endo β-1,4 glucanase appelé endocellulase (1,4- β-D glucan glucano hydrolase EC3.2.1.4), l’exo β-1,4 glucanase appelé exocellulase (1-4-β-D glucan cellobiohydrolase EC.3.2.1.91) et la β-1-4 Glucosidase appelé Cellobiase (β- D-glucosido glucohydrolase EC.3.2.1.21), il existe donc trois types d’activités enzymatiques cellulolytiques complémentaires pour l’hydrolyse totale de la cellulose :
- les endoglucanases (EG) appelé endocellulase ou 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4) qui coupent la cellulose aléatoirement au niveau des zones amorphes de la cellulose, générant de nouvelles extrémités de chaînes.
- les exoglucanases appelé exocellulase, comprenant les 1,4-β-glucane glucanohydrolases (EC 3.2.1.74) ou cellodextrinases et les 1,4-β-glucane cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91) ou cellobiohydrolases (CBH), qui agissent de façon processive sur les extrémités libres des chaînes de cellulose, libérant du glucose pour les glucanohydrolases ou du cellobiose pour les cellobiohydrolases.
- les β-glucosidases appelé Cellobiase ou β-glucoside glucohydrolases (EC 3.2.1.21) qui hydrolysent les cellodextrines solubles et le cellobiose en glucose.
Les systèmes cellulolytiques sont des systèmes multi-enzymatiques possédant ces trois types d’action, étant ainsi capables de dégrader totalement la cellulose, ce mécanisme d’hydrolyse enzymatique est résumé dans la (Figure 18), les deux premières étapes de ce mécanisme dégradent la zone amorphe de la cellulose, faite que, la région cristalline commence à être hydrolysée par l’action synergique des enzymes, cependant, les enzymes peuvent être
inhibées par le cellobiose, faisant diminuer l’efficacité de la réaction (Ovando et Waliszewki, 2005). La figure 18 montre les étapes du mécanisme d’hydrolyse de la cellulose par l’action synergique des enzymes afin de mieux comprendre ce procédé.
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Figure18 : Les trois types de réactions catalysées par des cellulases: 1. Rupture des interactions non covalentes présents dans la structure de la cellulose amorphe (endocellulase) 2. L’hydrolyse de la chaîne se termine à briser le polymère en petits sucres (exocellulase) 3. L’hydrolyse des disaccharides et tétrasaccharides en glucose (beta-glucosidase) selon (Ovando et Waliszewki, 2005).
Figure 19 : Détails mécanistiques de l’activité cellulase beta-glucosidase selon (Ovando et Waliszewki, 2005).
Les cellulosomes :
Les enzymes impliquées dans la dégradation de la cellulose, appelées communément cellulases, sont soit sécrétées dans le milieu (cas essentiellement des champignons), soit associées à la surface externe des micro-organismes formant des systèmes complexes appellés cellulosomes (cas des bactéries anaérobies) (Ballerini, 2006) ; ils contiennent environ cinq sous-unités enzymatiques différentes représentant, nommément Endocellulases Exocellulases, Cellobiases , Cellulase oxydative et de Cellulosephosphorylases dans lequel seulement les Endocellulases ,les Cellobiases vont participer à la réelle hydrolyse de la liaison β-(1 ,4) ,Clostriduim.cellulolyticum synthétise des complexes multi-enzymatiques de
600 kda appelés cellulosome, des complexes similaires sont produits par d’autres clostridies comme par exemple Clostriduim.thermocellum, Clostriduim.cellulovorans et Clostriduim.josui (Blouzard et al 2010) ; selon Querellou,2010, La cellulose peut être hydrolysé par l’action combiné d’aux moins 3 enzymes : une endoglucanases (Endocellulase) une exoglucanases (Cellobiohydrolase) et une β-glucosidase (Cellobiase) selon (Querellou, 2010).
La structure modulaire CBM (carbohydrate binding module) :
La plupart des cellulases ont une structure modulaire comprenant plusieurs domaines structuraux et fonctionnels, citant Le modèle « domaine catalytique – domaine d’accrochage à la cellulose » ou (CBM : carbohydrate binding module) est le plus souvent rencontré pour les systèmes excrétés selon (Ballerini, 2006).
Les CBM (carbohydrate binding module) facilitent l’hydrolyse de la cellulose en assurant l’ancrage du site catalytique sur le substrat, leur rôle est particulièrement important pour l’initiation de l’action des cellobiohydrolases et leur processivité, ils sont localisés aux extrémités de la protéine. Les CBM (carbohydrate binding module) interviendraient aussi dans la déstructuration des fibrilles de cellulose, ils sont souvent uniformes avec une face hydrophile et une face hydrophobe ; il existe également un bras de liaison entre le site catalytique et le CBM (carbohydrate binding module) constitué de fragments fortement glycosylés pour les cellulases fongiques et particulièrement riches en certains acides aminés comme la proline, la thréonine et la sérine selon (Ballerini, 2006).
Les sites catalytiques ont une configuration en crevasse pour les endoglucanases et en tunnel pour les exoglucanases afin de permettre le déplacement de l’enzyme le long de la chaîne de cellulose, les micro-organismes cellulolytiques possèdent plusieurs enzymes cellulolytiques de type endo et exo afin de pouvoir agir sur les zones amorphes et cristallines selon (Ballerini, 2006).
Les souches productrices de cellulases :
Les enzymes cellulases sont produites par une variété de bactéries productrices de cellulases extracellulaires capables d’hydrolyser la cellulose. Parmi eux les bactéries aérobies mésophiles et thermophiles, desquels les microorganismes thermophiles représentent un grand intérêt par leur capacité à produire la cellulase à des conditions extrêmes de pH et de température selon (Sugden et Bhat., 2000).
Parmi les bactéries cellulolytiques figurent des bactéries appartenant aux genres Clostridium
on y trouve Clostriduim.cellulolyticum bactérie mésophile, anaérobie stricte, à Gram positif
et mobile grâce à des flagelles péritriches ; elle a été isolée à partir d’herbe en décomposition
(Petitdemange et coll., 1984).
Bien que certaines bactéries comme Clostridium thermocellum produisent des cellulases ayant une activité spécifique (vitesse d’hydrolyse par unité massique de protéines) élevée, mais leurs capacités de production et leurs taux de croissance sont trop faibles pour envisager leur utilisation au stade industriel et en application biotechnologique (Ballerini, 2006).
Les bactéries aquatiques thermophiles sont des productrices de cellulases thermostable et quelques genres extrémophiles à titre d’exemples Bacillus. Stearothermophilus et autres espèces appartenant au genre Bacillus (Ibrahim et El Diwany, 2007), Bacillus subtilis (Bhat, 2000).
Aspect biotechnologique des enzymes polysaccharolytiques :
Amylases :
Actuellement, les α-amylases microbiennes sont parmi les enzymes les plus utilisés dans les procédés industriels autres qu’alimentaires (industrie pharmaceutique, textile, papeterie et détergents), en raison de leur productivité et thermostabilité (Burhan et al, 2003)
Une utilisation dans la glucoserie pour solubilisation de l’amidon, accompagnée d’une chute importante de la viscosité (liquéfaction), aussi dans la sucrerie pour réduction de la viscosité des sirops de cannes à sucre, en hydrolysant les contaminants amylacés pour réussir le processus de cristallisation, dans la Biscuiterie et la panification améliore les propriétés rhéologiques et fermentaires de la pâte, ainsi que le volume de la mie et la coloration de la croûte.
Passant à l’industrie textile les amylases sont utilisés dans le désencollage textile, qui permet d’éliminer la colle d’amidon qui enduit les fibres et les protège au cours du tissage.
Au secteur papetière ils sont utilisés dans la liquéfaction de l’amidon pour préparer des sauces de couchage, permettant d’éliminer les irrégularités superficielles de la feuille (Sicard, 1982). L’industrie des détergents utilisent les amylases pour la dégradation des taches à base d’amidon. Les oligosaccharides et les dextrines libérés de l’action hydrolytique sont solubles, par conséquent, la tache est physiquement découpée (Igarashi et al, 1998 ; Nielsen et Borchert, 2000)
L’industrie pharmaceutique a bénéficié du large spectre d’application des amylases elle les utilise comme agent anti-inflammatoire, un aide digestif (contre les dyspepsies et les fermentations intestinales) ainsi pour traitement du diabète et de l’obésité (Nielsen et Borchert, 2000).
Cellulases :
Les cellulases ont suscité beaucoup d’intérêts en raison de la diversité de leurs applications parmi les principales applications industrielles des cellulases le bio-polissage des tissus dans l’industrie textile et pour la production des medium de lentilles de regard, ainsi que dans les détergents à lessive pour améliorer la douceur et la luminosité de tissu, l’application des enzymes dans les industries du détergent, du cuir et du papier exige des hautes cellulases stables actives à des pH et des T°extrême (Cavaco-Pola, 1998).
En outre, ils sont utilisés dans l’alimentation animale pour améliorer la qualité nutritionnelle et la digestibilité, dans le traitement de jus de fruits, et en soude, tandis que le désencrage de papier est encore une autre application émergente, une zone potentielle stimulante où les cellulases aurait un rôle central est la bioconversion de la biomasse cellulosique renouvelable pour produits chimiques de base (Gong, et al, 1999; Homel, 1999)
La production de biocarburants de deuxième génération à partir de biomasse non alimentaire complexe (cellulose et hémicellulose) constitue un enjeu économique capital, mais les problèmes à résoudre sont multiples (Querellou, 2010), récemment en 2013 l’entreprise Iogen corporation (Canada) a mis au point un procédé utilisant des enzymes cellulolytiques qui optimisent la conversion de la cellulose en sucres fermentescibles qui servent par la suite à la production d’un carburant renouvelable qui est l’éthanol à faible émissions de gaz à effets de serre.
Pectinases :
Le champ d’application traditionnel des enzymes est la production de jus de fruits. Les Pectinases sont utilisées depuis des décennies pour la décomposition de pectines afin d’augmenter nettement le rendement du jus. La longue expérience pratique avec les Préparations d’enzymes pures, hautement actives et ayant une action spécifique servent à l’accroissement du rendement et des capacités de pressage tant dans l’industrie des jus de fruits ,les pectinases microbiennes sont une famille d’enzymes qui présentent un grand potentiel pour diverses utilisations industrielles, puisqu’elles sont capables de
dégrader la pectine, un polysaccharide trouvé dans les tissus de la plupart des végétaux, les pectine-lyases forment un groupe parmi les enzymes pectinolytique pourraient permettre de répondre à un nombre considérable de besoins dans des domaines comme le traitement des eaux usées, les biocomposites, les aliments pour animaux, le prétraitement des tissus, la fabrication du vin et des jus, les détergents, le désencrage du papier et le mûrissement des aliments (Desmarteaux et al , 2012).
Récemment, l’entreprise DSM a lancé une nouvelle pectinase, enzyme destinée à la clarification des jus de pomme et de poire, qui permet de dégrader plus rapidement la pectine. D’après le groupe, cette pectinase commercialisée sous le nom de Rapidase Smart Clear, permet d’améliorer la qualité des jus de fruits obtenus (Lilian, 2006)
Un projet, entrepris de concert avec Ressources naturelles Canada, porte sur la pectinase, enzyme capable de désagréger les fibres de chanvre inutilisées ceci rentre dans le cadre d’un programme de biocatalyse de l’IRB-CNRC vise à trouver des enzymes bactériennes qui remplaceront les substances chimiques dangereuses employées pour fabriquer les spécialités pharmaceutiques, les composés chimiques et d’autres produits (Anonyme, 2006)