L’isolement des vibrions en Algérie a été réalisé à partir de 35 souches bactériennes dans les zones humides classées Ramsar d’Oran et de Bechar. L’étude évalue également la résistance aux antibiotiques et le contenu plasmidique des isolats, contribuant à la compréhension de la biodiversité microbienne locale.
GNAB (gélose, nutritive, alcaline, bilié) :
Très utilisé pour la recherche des vibrions surtout V.cholerae
Germe recherché : Vibrions halophiles……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Faire bouillir environ 57,5g du déshydratas de la forme commercialisé du milieu dans 1000 ml d’eau distillé sous agitation à une T° de plus de 80 C° environ sous une plaque chauffante dont les constituants sont la peptone 20g, extrait de bœuf 5g ,5gNacl, sel biliaires des bovins et 15g agar après la dissolution complète de la poudre et l’ajustement du pH à 8,3 (Hopbiol,2011).
Répartis le volume sur des flacons de 250 ml par la suite faire un autoclavage à 121°C pendant 20 min et pour l’utilisation le milieu liquéfié est coulé en boite de pétris le couvercle semi ouvert pour le refroidissement les boites ensuite mis dans l’étuve pendant 24 h pour vérifier s’il y a eu une éventuelle contamination.
Mode d’ensemencement et principe :
Selon Guiraud, 2003, un enrichissement est réalisé en eau peptonée hypersalée alcaline (Nacl 3% et PH=8,6) pendant 6 à 24 heures à37°C, la positivité de l’enrichissement se traduit par un voile bactérienne à l’interface air/milieu, un aliquot prélevé sous la surface du bouillon d’enrichissement est ensemencé sur la gélose du GNAB après incubation à 37°Cpendant 48 heures chaque colonie subit une pré-identification (coloration de Gram et test d’oxydase) pour confirmé le genre Vibrio.sp
L’ensemencement se fait à la surface de la gélose GNAB par inondation ou par gouttes déposés par micropipette
Lecture des résultats :
Après une incubation de 18 à 24 heures les colonies de 2 à 4 mm de diamètres à contour régulier, plates, transparentes de couleur bleutée représentent effectivement le genre Vibrio (Blidapharm, 2012) ; défois les colonies suspectes d’être des vibrions apparaissent blanche bleuté lisse opaque ressemblant à un liquide laiteux.
Milieu M17 :
Ce milieu est destiné à la culture des lactocoques dont les Leuconostoc (Terzaghi et Sandine, 1975) ainsi les Streptococcus (Haho, 2009).
Germe recherché : Streptococcus, Leuconostoc……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Nous avons utilisé le milieu déshydraté prés à l’emploi dont la composition et la suivante :tryptone5g, peptone de soja 5g, infusion de viande 5g, extrait de levure 2,5g,glycerohydrogenophosphate de sodium19g ,acide ascorbique0,5g, sulfate de magnésium 0,25g les 48,5g de poudre dissoute dans 950 ml d’eau distillée ajouter extemporanément 50ml de solution de lactose à 100g par litre ajustement du pH à 6,9 par une solution tampon suivi d’un autoclavage classique la forme solide du milieu M17est obtenu par ajout d’agar avant l’autoclavage à la concentration de 11g/l (Terzaghi et Sandine,1975)
Refroidir et maintenir le milieu à 47°C, transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales dans des boîtes de Pétri stériles, couler 15 ml de milieu, homogénéiser parfaitement, laisser solidifier sur une surface froide puis incuber :
à 37°C pendant 48 heures pour Streptococcus à 30°C de 48 à 72 heures pour les lactocoques mésophiles (Haho, 2009).
Mode d’ensemencement et principe :
L’ensemencement se fait par inondation, les peptones de caséine, de viande et de soja contiennent les sources de carbone et d’azote nécessaires à la culture des lactocoques, l’extrait de levure est une source de vitamines du groupe B, l’acide ascorbique agit comme stimulateur de croissance, le lactose est fermenté en acide lactique qui est neutralisé en présence de glycérophosphate (Haho, 2009).
Lecture des Résultats :
Streptococcus et les lactocoques mésophiles donnent des colonies qui atteignent 1 à 2 mm de diamètre, suivant le nombre de colonies présentes dans la boîte ; vérifier au microscope qu’il s’agit bien de cocci à Gram positif en chaînettes ou en diplocoques (Haho, 2009).
Gélose viande foie sulfute de sodium GVFS :
La gélose viande-foie sulfite est un milieu complet utilisé pour le dénombrement des spores de Clostridie sulfito réducteurs utilisé pour la recherche des micro-organismes anaérobies sulfito réducteurs dans les eaux, les micro-organismes mis en évidence sont les spores de Clostridies sulfito-réducteurs : Clostridium perfringens et Clostridium sporogenes (Gastellier, 2006).
Germe recherché : Clostriduim.perfringens……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Mettre en suspension 48,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée ou, puis porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, répartir en tubes, à raison de 20 mL par tube, puis stériliser à
l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes le mode d’emploi consiste à refroidir et maintenir le milieu à 44°C, chauffer le produit à analyser afin de détruire les formes végétatives et d’activer les spores selon (Gastellier, 2006) ; ce chauffage se fait à 80°C pendant 10 min, transférer le milieu dans un tube contenant 5 ml de l’inoculum ou de ses dilutions, en évitant au maximum d’incorporer d’air, homogénéiser parfaitement, par retournement complet, refroidir dans un bain d’eau glacée ,puis incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures (Haho,2009).
Mode d’ensemencement et principe :
Pour un dénombrement classique en boîte , transférer le milieu dans un tube contenant 1 ml de l’inoculum ou de ses solutions décimales, en évitant au maximum d’incorporer d’air puis homogénéiser parfaitement et laisser solidifier, concernant un dénombrement classique en gélose profonde, introduire dans le tube de gélose en surfusion 1 ml d’inoculum en enfonçant la pipette jusqu’au fond, remonter rapidement en spirale en relargant progressivement l’inoculum ou effectuer un retournement complet en évitant l’introduction de CO2 et refroidir dans un bain d’eau glacée (Gastellier, 2006).
La peptone viande-foie assure la croissance des germes anaérobies, le glucose constitue la source énergétique du développement alors que l’amidon favorise la germination des spores, les germes anaérobies réduisent les sulfites en sulfure qui, en présence de citrate ferrique, provoque l’apparition d’un halo noir autour des colonies par la formation de sulfure de fer (Gastellier, 2006).
Incuber à 37°C ou à 46 °C (Clostridium perfringens) pendant 24 et 48 heures, l’incubation des boîtes pour le dénombrement classique doit être réalisée en jarre d’anaérobiose (Gastellier, 2006).
Lecture des Résultats (voir figure 27) :
Une première lecture après 16 heures d’incubation, après cette période ils seront considérés comme positif, les tubes contenant de grosses colonies noires, qui corresponds au Clostridium sulfito-réducteur (Hamed et al, 2012).
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1
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2
Figure 27: Aspect du milieu GVFS avant(1) et après incubation(2) (Gastellier, 2006).
Gélose MRS:
Ce milieu gélose employé pour la culture et le dénombrement des Lactobacillus, a été défini en 1960 par Man, Rogosa et Sharpe
Germe recherché : Lactobacillus, Leuconostoc.
Préparation et le mode d’emploi :
Le déshydratât d’un poids d’environ 61,5g est additionnée à un volume de 1 litre d’eau distillé sous agitation thermique après dissolution, en ajoutant un volume de 1ml de Tween 80 au mélange puis le faire répartir en flacon de 250 ml est autoclaver à 121C° pendant 15min pour une éventuelle utilisation on procède à une liquéfaction en verse le contenue d’un flacon sur 6 boites de Pétri d’un diamètre de 4 mm puis on conserve les boites dans un endroit stérile à une basse T°.
Mode d’ensemencement et principe :
Transférer 1 ml de l’eau à analyser et de ses dilutions décimales dans des boîtes de Pétri Stériles, puis couler 15 ml de milieu, homogénéiser parfaitement, laisser solidifier sur une surface froide, placer les boîtes ensemencées dans les conditions spécifiées dans le mode opératoire choisi, incuber à 30 ou 37°C pendant 2 à 3 jours, suivant le cas (Haho, 2009).
en principe toutes les bactéries lactiques telles les lactobacillus et Leuconostoc se développent grâce à l’acidité du milieu en principe la peptone, le glucose et les sels de manganèse et de magnésium apportent les éléments nutritifs indispensables à la croissance des lactobacilles, le Tween 80, mélange d’esters oléiques, est une source d’acides gras nécessaires à la croissance de ces germes, le phosphate dipotassique contribue à stabiliser le pH au cours de la croissance bactérienne, le citrate d’ammonium et l’acétate de sodium constituent les substances inhibitrices du développement de la plupart des contaminants tels que les streptocoques et les moisissures (Haho, 2009).
Lecture des résultats :
Les colonies de Lactobacillus apparaissent après 24 à 36 heures d’incubation à 30°C. D’un diamètre de 0,5 à 1mm, elles ont des contours nets ou irréguliers, leur forme est généralement circulaire, elles sont opaques, de consistance homogène ou discrètement granuleuse, incolores ou blanchâtres. Certaines espèces comme Lactobacillus.bulgaricus se développent plus lentement (36 à 48 heures). Les colonies de Leuconostoc apparaissent après 24 à 36 heures d’incubation à 30°C sous forme de petites colonies arrondies de contour régulier blanchâtres.
Remarque au usage des milieux de cultures et sélectifs :
Une liquéfaction partielle de l’agar entraînera inévitablement une altération significative de la consistance du gel du milieu solidifié, après stérilisation et refroidissement, le stockage et la conservation de toutes ses milieux de cultures et sélectifs se fait à une basse T°
Repiquage et conservation: (Marchal et al, 1982).
[20_img_3]Les colonies suspectes repérées sur les différents milieux d’isolement sont sélectionnées, puis repiquées sur gélose nutritive inclinée en tube. Le but de cette opération est la purification des souches et l’obtention de cultures pures qui serviront au processus d’identification ultérieur. Le schéma 6 résume la technique de purification et de conservation.
Culture pure
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Ensemencer
Après repiquage
sur les différents milieux de
culture
Ensemencer la gélose nutritive inclinée
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Prélever une colonie
Conserver à 4°C
Figure 28: Technique de Purification et de Conservation.