Analyse des enzymes pectinolytiques dans les zones humides en Algérie

Les enzymes pectinolytiques en Algérie jouent un rôle crucial dans l’éco-bactériologie des zones humides classées Ramsar, comme celles de la région d’Oran et de Bechar. Cette étude analyse 35 souches bactériennes, leur résistance aux antibiotiques et leur activité enzymatique, mettant en lumière leur potentiel écologique.

1. 1. Les enzymes pectinolytiques :
      1. Origines et propriétés :

Bien que les substances pectiques ne puissent être considérées comme formées uniquement d’acide anhydrogalacturonique, le terme enzymes pectinolytiques ou «pectinases» ne conserne que les enzymes dégradant la partie galacturonique de ces substances selon (Mateos et al, 1992). Ainsi les enzymes capables de dégrader les chaînes latérales (arabinases, galactanases….) ne sont pas classées parmi les enzymes pectinolytiques. Les enzymes coupant les liaisons (1-4) entre résidus galacturonique et les enzymes désestérifiantes ces acides constituent donc les acides pectinolytiques au sens strict selon (Wiseman, 1978).

Deux groupes d’enzymes sont à distinguer :

1. Les enzymes désestérifiantes ou saponifiantes (pectine méthyl estérases).
2. Les enzymes dépolymérisantes ou enzymes pectinolytiques (hydrolases et lyases).

La présence de péctinases a été démontrée chez de très nombreux microorganismes surtout les bactéries selon (Pruner et Kaiser, 1964) (Starr, 1961) (Voir Tableau).

1. 1. 1. Définition et structure chimique des substances pectiques

Les substances pectiques sont des macromolécules glucidiques largement répandues dans le règne végétal où elles constituent avec l’hémicellulose et la cellulose l’un des composants majeurs de la paroi des cellules végétales selon (Chamier et Dixon, 1982)et (Albersheim et Killias, 1962), elles sont localisées dans la lamelle moyenne et dans la paroi primaire des cellules végétales. Le terme « substances pectiques » est le terme générique pour les macromolécules contenant des acides galacturonique polymérisés (Thibault et Petit ,1979).

Les acides polygalacturonique sont des substances pectiques formées uniquement d’acides galacturonique liés entre eux par une liaison osidique α (1-4) selon (Thibault et Petit ,1979). Les acides pectiques, contiennent en plus de l’acide polygalacturonique, une proportion plus au moins importante d’oses neutres : rhamnose, galactose et arabinose sont les oses les plus couramment rencontrés et la teneur en oses neutres est d’environ 10 à 20 ℅.

Il a été montré que le rhamnose fait partie de la chaîne principale d’où le nom de rhamnogalacturonane. Ce méthyle pentose est lié aux acides galacturonique par son carbone 1 et 2,les autres oses neutres sont liés, soit au C 4 du rhamnose, soit au C 2 et/ou C 3 des acides galacturonique, formant ainsi des chaînes latérales d’arabinanes, de galactane et/ou d’arabinogalactane.

Alors que la xylose, le glucose, le mannose, sont beaucoup moins fréquents selon (Baron et Thibault, 1985), les fractions carboxyliques de la chaîne principale des acides pectiques une fois neutralisées par des ions monovalents ou divalents, tel que : K+, Na+, et Ca²+ donnent des sels appelés : les pectates selon (Ladjama ,1991).

Les acides pectiniques sont des acides pectiques dont certaines fonctions carboxyliques sont estérifiées par du méthanol selon (Thibault et Petit ,1979).

En effet, c’est sur la base du degré d’estérification (DE) des fonctions alcool de l’acide galacturonique par le méthanol que les substances pectiques sont classées en :

• Pectines faiblement methylées (PFM) si elles ont un degré d’estérification inférieur à 50℅
• Pectines hautement methylées (PHM) si elles ont un degré d’estérification supérieur à 50℅ selon (Ladjama ,1991).

Dans la nature, les substances pectiques sont le plus souvent hautement methylées; les pectines faiblement méthylées sont obtenues par désestérification chimique ou enzymatique des pectines selon (Sakai et al, 1993).

Quelques substances pectiques présentent un autre type d’estérification, il s’agit surtout des pectines extraites de marcs de betteraves dont les fonctions alcools secondaires sont estérifiées par l’acide acétique. Cette acétylation, toujours limitée, gêne la gélification de ces substrats selon (Fenghour ,1998).

1. 1. 1. Rôle et emploi des substances pectiques :

Les substances pectiques sont localisées dans des lamelles moyennes et dans la paroi primaire des cellules végétales, associées aux autres constituants pariétaux ; par leur grande hydrophilie, elles peuvent jouer un rôle dans la régulation du métabolisme de l’eau dans la plante selon (Ladjama ,1991).

Ces substances pectiques interviennent dans l’évolution des produits végétaux, en effet, elles jouent des rôles essentiels dans les modifications des structures cellulaires au cours de la maturation, du stockage et du traitement thermique des fruits et légumes et dans les techniques de transformation des produits végétaux (pressurage et filtration des jus de fruits).

Ces transformations sont, en générale, liées à l’action d’enzymes pectinolytiques,une fois extraites de produits végétaux (sous-produits, des industries des jus de fruits tels que les marcs de pomme et les écorces d’agrumes), les substances pectiques sont utilisées industriellement comme additifs alimentaires. Leurs propriétés stabilisantes, épaississantes et gélifiantes sont connues depuis longtemps puisque Braconnot, en 1825, a donné le nom de pectine à des substances qu’il avait extraites des fruits et qui gélifiaient en milieu acide selon (Baron et Thibault, 1985).

En effet, les pectines hautement methylées sont utilisées essentiellement dans les confiseries, les confitures, les biscuiteries et les pâtisseries. Par contre, les pectines faiblement methylées sont utilisées comme additifs alimentaires, pour leurs propriétés épaississantes et stabilisantes dans les produits lactés et diététiques (laits gélifiés, flans) selon (Sakai et al, 1993),les pectines, ne présentent aucune toxicité, ne sont pas digérées par l’Homme, font partie des fibres alimentaires et peuvent présenter, surtout en nutrition humaine, des actions favorables selon (Baron et Thibault, 1985).

De nombreuses recherches médicales ont mis en évidence le rôle important que pourrait jouer la pectine dans le traitement de certains diabètes, ulcères, et gastrites selon (Truswell, 1977).

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Figure 12: Structure du squelette polygalacturonique des pectines (Baron et Thibault, 1985).

1. 1. 1. Les différents types d’enzymes pectiques et caractéristiques :
         1. Les enzymes de dé-estérification :

D’après la classification de l’Union Internationale de Biochimie (UIB), ces enzymes sont appelées « pectine méthyl estérases» (EC : 3.2.1.11) elles hydrolysent les fonctions esters méthyliques de la pectine en libérant l’acide polygalacturonique et du méthanol selon (Durand et Monasan, 1982), ces enzymes agissent en générale en synergie avec les polygalacturonases et les pectates lyases qui nécessitent pour leur action de désestérification préalable (par voie chimique ou par la péctine méthyl estérase) du substrat selon (Rexova- Benkova et Markovic , 1976)

1. 1. 1. 1. Les enzymes dépolymérisantes :

Selon la nature de la réaction chimique mise en jeu au cours de la dépolymérisation et du clivage des liaisons glycosidiques, ce groupe d’enzymes se subdivise en deux :

1. Les hydrolases ou polygalacturonases.
2. Les lyases ou transéliminases.

Les hydrolases ou polygalacturonases :

Ces enzymes hydrolysent l’acide pectique, provonant de la demethylation de la pectine, en libérant des oligomères galacturonique saturés selon (Rexova- Benkova et Markovic , 1976). Les polygalacturonases sont produites par divers micro-organismes tels que les bactéries (Pseudomonas sp., Erwinia chrysanthemi) selon (Gillings et al, 1993).

Selon le mode d’action de l’enzyme, les polygalacturonases se subdivisent en :

1. Les endo polygalacturonases (EC : 3.2.1.15) :

Sont souvent produites sous formes moléculaires multiples ou sous formes d’isoenzymes, le poids moléculaire de ces enzymes est inférieur à 60000, et en général, de l’ordre de 40000. Le point isoélectrique (pHi) se situe entre 4 et 7 ; certain d’entre elles sont des glycoprotéines. Le

pH optimum est généralement acide et varie de 4 et 6, seule une souche d’un champignon microscopique Corticium rolfsii secrète une polygalacturonase active à pH optimal particulièrement bas de 2.5, les endopolygalacturonases sont fortement activée par les ions monovalents alors que les cations divalents ne sont pas activateurs ; elles sont spécifiques des acides polygalacturoniques qui constituent leur substrat préférentiel et les produits finaux de l’hydrolyse sont le plus souvent l’acide galacturonique et son dimère saturé selon (Boudart et al, 1995)

1. Les exopolygalacturonases (EC : 3.2.1.67) :

Ces enzymes montrent une spécificité très étroite vis-à-vis des substances pectiques non méthylées : elles n’hydrolysent que très faiblement les pectines. En plus de l’effet des esters méthyliques, l’action de l’enzyme peut être bloquée pour une irrégularité structurale du substrat telle qu’un résidu rhamnose ou une chaîne latérale ; la majorité des polygalacturonases attaquaient l’acide pectique par l’extrémité non réductrice de la chaîne selon (Kalaitzis et al, 1995)

Il existe, par ailleurs, des exceptions, ainsi une exoplygalacturonase isolée d’une souche Bacillus sont actives sur des oligomères ayant une double liaison en position C4-C5 du coté non réducteur selon (Lester et al, 1994)

Le produit final de l’hydrolyse d’un acide polygalacturonique par les exopolygalacturonases est l’acide galacturonique, sauf dans le cas des enzymes secrétées par Pseudomonas et par Erwinia qui libère de l’acide digalacturonique selon (Stotz et al, 1993)

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Figure 13: Réactions catalysées par les différentes enzymes pectolytiques (Baron et Thibault, 1985).

Les lyases ou transéliminases :

Ces enzymes ont été découvertes en 1960 par P. Albersheim et coll. Elles dépolymérisent les substances pectiques avec formation d’oligomères insaturés en position Δ 4 -5 du coté non réducteur par β élimination (voir figure 14) selon (Rexova et Benkova, 1976).

Ce mécanisme de β élimination a été démontré chez plusieurs microorganismes d’origine bactérienne (Pseudomonas fluorescens, Erwinia crotovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia avoideae, Bacillus subtilis, Xanthomonas sp, Clostridium sp.) selon (Ladjama ,1991).

1. Les endopectates lyases (EC : 4.2.2.2) :

Sont des protéines dont le poids moléculaire se situe entre 28000 et 52000. Le pH optimum de leur activité est généralement basique et se situe entre 8 et 9.5, leur pHi est souvent compris entre 8 et 11,pour être actives, ces enzymes requièrent obligatoirement la présence de cations divalents, plus particulièrement de calcium, l’addition d’agent séquestrant tel que le sel de l’acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) Complexant les ions divalents, inactive les endopectates lyases selon (Baron et Thibault, 1985).

Le substrat préférentiel de ces enzymes est l’acide polygalacturonique selon les ex auteurs.

1. Les exopectates lyases (EC : 4.2.2.9) :

Qu’elles soient d’origine fongique ou bactérienne, les exopectates lyases présentent une grande similitude de propriétés. Elles dégradent l’acide polygalacturonique qu’elles clivent à partir de son extrémité réductrice pour libérer les dimères insaturés ou des acides digalacturonique insaturés (voir figure 14) selon (Rexova et Benkova, 1976)

1. Les pectines lyases (EC : 4.2.2.10) :

Dans ce groupe d’enzymes, toutes les pectines lyases connues sont de type endopectine

Lyases (EC : 4.2.2.10) avec l’exception d’une exopectine lyase isolée de l’espèce Erwinia carotovora selon (Ladjama ,1991) ; les pectines lyases ne nécessitent pas de cations ;Toutefois, le calcium, le magnésium modifient l’activité enzymatique, mais l’effet dépend du pH et du degré de méthylation,sur les pectines hautement estérifiées, ils sont activateurs aux pH supérieurs à 6.5, inhibiteurs entre pH 5.8 et 6.5 et sans aucune influence au dessous de pH=5.3 (Aux degrés d’estérification inférieurs à 86 ℅, les cations divalents sont activateurs quelque soit le pH) selon la littérature scientifique.

La pectine hautement méthylée ou totalement méthylée « Linke pectine » est le substrat préférentiel le plus favorable pour ces enzymes selon la littérature scientifique ; les produits libérés lors de la réaction, sont des oligogalacturonates insaturés méthylés selon (Baron et Thibault, 1985).

1. 1. 1. 1. Classification des enzymes dépolymérisantes :

Selon la littérature scientifique la classification des dépolymérases est basée sur :

1. Le mode d’attaque de l’enzyme à l’intérieur ou à l’extérieur des chaînes.
2. La nature de la réaction chimique mise en jeu au cours de la dépolymérisation.
3. Le substrat préférentiel.

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Figure 14 : Les différentes voies de la dégradation enzymatiques des pectines (Baron et Thibault, 1985).

1. 1. 1. 1. Mode d’action de l’enzyme :

Certaines dépolymérases attaquent au hasard le polymère à l’intérieur de la chaîne (endoenzymes), alors que d’autres (exo-enzyme) ont une action récurrente à partir de l’extrémité réductrice ou non du polymère, libérant ainsi successivement, soit des oligomères d’acide galacturonique de taille importante et variée dés les premiers stades de la réaction, soit l’acide galacturonique ou plus généralement de courts oligomères, digalacturonate ou trigalacturonate saturés ou insaturés selon (Rexova et Benkova, 1976).

Deux techniques principales permettent de distinguer de telles activités. La première repose sur la comparaison de la baisse de viscosité produite dans le milieu réactionnel avec le nombre de liaisons glycosidiques rompues. Une endo-enzyme provoquera une baisse de 50%de la viscosité alors que seulement 5 à 10% des liaisons sont rompues; en revanche, un nombre beaucoup plus important de liaisons, supérieur à 20%, doivent être coupées par une exo-enzyme pour atteindre la même baisse de viscosité. La deuxième technique consiste à séparer, par différentes méthodes chromatographiques, (sur papier, sur couche mince, sur colonne,…) les produits de la réaction en fonction du temps selon (Baron et Thibault, 1985).

1. 1. 1. 1. Nature de la réaction :

La réaction catalysée par les dépolymérases peut être, soit une hydrolyse soit une β élimination les premieres enzymes sont des hydrolases (polygalacturonases), les secondes des Lyases, terme préféré à celui de transéliminases (voir Figure 15). (Baron et Thibault, 1985).

1. 1. 1. 1. Substrat préférentiel

L’étude de l’influence du degré d’estérification (DE) du substrat sur l’activité de l’enzyme permet de distinguer les dépolymérases attaquant préférentiellement l’acide polygalacturonique et celles dégradant les pectines plus au moins estérifiées. Suivant ces critères, il existe donc cinq types d’enzymes pectolytiques dépolymérisantes: les polygalacturonases (endo et exo), les pectates lyases (endo et exo) et l’endopectine lyase.

Actuellement, sept enzymes sont recensées par l’Union Internationale de Biochimie, car sont présentes sur cette liste, deux exopolygalacturonases, l’une produisant de l’acide

[12_img_6]polygalacturonique (EC : 3.2.1.67) et l’autre beaucoup moins répandue, produisant des acides digalacturonique (EC : 3.2.1.82) et une lyase attaquant préférentiellement les oligomères de l’acide polygalacturonique (EC : 4.2.2.6) selon (Rexova et Benkova, 1976).

Figure 15 : Mécanisme de β élimination par les lyases (Herron et al, 2000)

1. 1. 1. 1. Les souches productrices de pectinases :

++ : Production totale

+ : Production partielle

Selon un très grand nombre d’auteurs qui ont cerné la présence de l’activité pectinolytique chez quelques genres bactériens tels : Erwinia, Aeromonas, Xanthomonas, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Clostridium on trouve également d’autre genre capable de produire partiellement un type d’enzyme pectique ou totalement tous les pectinases citées auparavant (voir tableau) à titre d’exemple des souches de Lactobacillus sont susceptibles de produire la pectinesterase (PE; pectine pectylhydrolase,EC 3.1.1.11), la polygalacturonate lyase (PGL) et la polygalacturonase (PG; poly (1,4-α-d-galacturonide) glycanohydrolase, EC 3.2.1.15) comme l’espèce Lactobacillus plantarum selon (Djouldé Darman, 2005)