Le dénombrement des germes en Algérie est réalisé dans les zones humides classées Ramsar d’Oran et de Bechar, en isolant 35 souches bactériennes. Cette étude évalue leur résistance aux antibiotiques et leur contenu plasmidique, en utilisant des techniques de culture spécifiques à différentes températures.
3. Dénombrement des germes totaux :
La recherche et le dénombrement des germes revifiables se réalisent à deux températures différentes afin de cibler les micro-organismes psychrophiles (22°C) et les microorganismes, mésophiles (37°C). Le milieu de culture est de la gélose glucosée tryptonée à l’extrait de levure (TGEA) fondue puis refroidie à 45°C. Les dilutions décimales vont de 1/10 à 1/10000, en double dans des boites de Pétri. Après ensemencement les boites sont partagées en deux séries distinctes:
- La première série est incubée à 22°C pendant 68 heures.
- La seconde série est incubée à 36°C, pendant 44 heures.
Le calcul ensuite de la valeur du nombre (N), de microorganismes revifiables à 22°C, et celle du nombre (N) de microorganismes revifiables à 36°C à part, en tant que moyenne pondérée,
sera fait suivant l’équation:
CN =1,1 x D
C : Somme des colonies dénombrées sur deux boites de dilutions successives retenues
D : Taux de dilution correspondant à la première dilution
Le résultat final de microorganismes revifiables dénombrés à 22°C et à 37°C par ml d’eau est exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10ˣ où le x est la puissance appropriée de 10 (Lebres et Mouffok, 2008), Si les boites ensemencées, contiennent plus de 300 colonies, les résultats sont exprimés 3.102 (ISO, 1990 et ISO 6222, 1999).
9 ml d’eau physiologique dans chaque tube
1 ml
1 ml 1 ml 1 ml
1 ml 1 ml
Echantillon Mère
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
1ml de chaque dilution + TGEA
Figure 26: Schéma représentatif de la technique du dénombrement des germes totaux
Les milieux de cultures utilisés : (Composition chimique Voir annexe)
Nous avons utilisé une large gamme des milieux de cultures favorables aux développements des bactéries des milieux ordinaires et sélectifs (Materiels biologique).
Les Milieu ordinaire et d’isolement :
La gélose nutritive, la gélose tergitol TTC, Tryptone Extrait de levure glucose TGEA
Gélose nutritive ordinaire :
La Gélose Nutritive est un milieu largement utilisé pour la culture des micro-organismes peu exigeants, elle est recommandée dans de nombreuses méthodes standardisées d’analyses des aliments, des laitages, de l’eau et d’autres produits (Eaton, 1995),ce milieu de culture pour l’isolement de la majorité de la flore bactérien vue sa composition chimique équilibré et son PH neutre, contient la peptone et l’extrait de viande comme source d’azote et l’extrait de levure comme source de carbonne peut être préparé au laboratoire ainsi disponible dans la plus parts des cas sous forme de poudre commerciale déshydratée qui nécessite que l’addition de l’eau distillée et l’autoclavage (Guillaume, 2004).
Germe recherché : tous genres bactériens sans une exception.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre le déshydrata contenant la poudre de la gélose nutritive dans 1litre d’eau distillé porter à l’ébullition doucement sous un mouvement d’agitation, ajuster PH puis verser dans des flacons et autoclaver à 121°C.
Il s’agit d’une préparation liquide qui se gélifie grâce à l’agar à une température ambiante, on verse cette préparation dans des boites de pétri qui sont alors mises en incubation après l’inoculer par l’échantillon d’eau
Mode d’ensemencement et principe :
Par inondation de la surface du milieu coulé en boites de Pétri
Lecture des résultats :
Après 24 heures d’incubation à 37°C en aérobiose :
Généralement pour la recherche des bactéries aux caractères non exigeants, pour les résultats obtenus il peut y avoir des colonies de couleur caractéristiques (Guillaume, 2004).
Faire un examen macroscopique des colonie, la gélose ordinaire est un milieu de base, une culture sur ce milieu prouve la non exigence de la souche (Veron, 2013).
Milieu TTC tergitol :
Milieu de recherche et de dénombrement des coliformes ; il est surtout utilisé pour la colimétrie des eaux par la méthode de filtration. (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Escherichia. Coli et d’autres coliformes.
Préparation et mode d’emploi :
Verser 54,0 g de poudre dans un litre d’eau distillée, porter à ébullition lentement, en agitant jusqu’à dissolution, distribuer en flacons, puis autoclaver 15 min à 121°C (AES,2009).
Liquéfier le milieu puis le refroidir vers 50°C, dans 100 ml de gélose fondue, ajouter : 5 ml de solution de Tergitol 7 à 0,2 % et 5 ml de solution de T.T.C. à 0,05 %, il est impératif de bien mélanger base gélosée et solutions aqueuses stériles en évitant l’incorporation de bulles d’air. couler en boîtes de Pétri stériles de diamètre 55 mm de manière à ce que l’épaisseur du milieu soit d’au moins 5 mm (AES, 2009).
Faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercles entrouverts, dans le cas de la méthode des membranes filtrantes, chaque échantillon à analyser nécessitera l’emploi d’une membrane (stérile, diamètre 47 mm, porosité minimum de 0,45 μm) déposées sur une boîte. Veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne s’interpose entre membrane et gélose ; puis incuber la boîte retournée à 36 °C pendant 21 heures. (AES, 2009)
Mode d’ensemencement et principe :
Méthodes de membrane filtrante (voir figure 03 annexe) ,par dépôt sur le milieu puis le faire inondé ; le principe du milieu repose sur l’aptitude des coliformes à fermenter le lactose, la production d’acide entraînée par cette fermentation provoque un virage de l’indicateur coloré au jaune et une coloration des colonies en jaune ou orangé avec formation d’un halo jaune ,le Tergitol 7 (heptadécylsulfate de sodium), additionné extemporanément au milieu de base, inhibe la pousse des germes à Gram positif, réduit l’envahissement du milieu par les Proteus et favorise le recouvrement des coliforme ,les autres bactéries à Gram négatif vont réduire le
T.T.C. (Triphényl-2, 3,5-Tétrazolium Chlorure) en formazan ce qui va colorer leurs colonies en rouge (AES,2009).
Lecture des résultats :
Colonies jaunes avec halo profond jaune sont Colonies jaunes avec halo profond jaune sont d’E.coli fécale, après 16 à 24 heures d’incubation à 44 C°
Le milieu Tryptone Extrait de levure glucose TGEA :
La gélose glucose troponine (TGEA) correspond bien aux microorganismes des milieux aqueux (Gambro, 2002), utiliser généralement pour la recherche et le dénombrement des germes revivifiables et qui se réalisent à deux T° différentes afin de cibler les micro- organismes psychrophiles (22°C) et les microorganismes, mésophiles (37°C) (Lebres et Mouffok, 2008), Cette procédure s’applique à tous les types d’eau (Sar, 2012).
Germe recherché : Clostridium, Flavobacterium, Aeromonas……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre en suspension 19,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée puis porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, répartir en tubes et en flacons, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min (Haho, 2009) ; si le milieu est préparé à l’avance à partir du milieu déshydraté, faire fondre la gélose pendant le minimum de temps nécessaire à sa reliquéfaction totale, refroidir et maintenir à 44°C, transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives dans des boîtes de Pétri stériles ,couler 10 à 15 ml de milieu homogénéiser parfaitement ,laisser solidifier sur une surface froide enfin, Incuber :
un jeu de boîtes à (36 ) °C pendant (44) heures, et un autre à (22 )°C pendant (68 ) heures
(Haho, 2009).
Mode d’ensemencement et principe :
L’incorporation des échantillons et de leurs dilutions à la gélose s’effectue dans des conditions d’asepsie sous hotte près d’une flamme de bec Bunsen ; maintenir la gélose en fusion dans un bain marie jusqu’à stabilisation de sa T° à 45°C, pendant un maximum de 4 h avant utilisation (Sar, 2012).
Après mélange vigoureux de l’échantillon, répartir les prises d’essai dans les boîtes de Pétri à l’aide une pipette à usage unique stérile (Sar, 2012).
Verser la gélose liquide de manière à obtenir une couche d’un minimum de 3 à 4 mm d’épaisseur. (Cette opération doit se faire dans les dix minutes qui suivent l’inoculation de la boîte) (Sar, 2012).
Homogénéiser ce mélange par des mouvements circulaires (3 à gauche et 3 à droite) et linéaires (3 avant – arrière et 3 gauche – droite) en évitant la formation de bulles et sans mouiller les bords supérieurs de la boîte puis laisser à refroidir les boîtes sur une surface plane (Sar, 2012).
Les substances nutritives apportées par la Tryptone et les facteurs vitaminiques de l’extrait de levure favorisent la croissance de la plupart des bactéries à dénombrer (Haho, 2009).
Lecture des résultats : (Sar, 2012)
Après solidification de la gélose, retourner les boîtes et les placer dans l’incubateur Laisser incuber dans l’enceinte réglée à 22°C pendant 68 h ou à 36°C pendant 44 heures.
Examiner les boîtes dès la fin de l’incubation si non les conserver à environ 4°C pendant 24 heures au maximum.
Lorsque plusieurs dilutions sont effectuées, dénombrer les colonies sur la gélose présentant entre 15 et 300 colonies.
Comptabiliser toutes les colonies présentes à l’aide d’un compteur de colonies.
Calcul et expression de résultats : (Sar, 2012)
Le calcul des résultats s’effectue par la moyenne des dénombrements réalisés sur les répliques de la dilution retenue (voir figure 26 page 106).
Le résultat s’exprime en nombre de germes dans le volume de référence (généralement 1 ml).
Lorsque aucune colonie n’apparaît dans la gélose inoculée avec le volume d’essai de l’échantillon non dilué, le résultat est exprimé sous la forme de « non détecté dans 1 ml ».
En présence de plus de 300 colonies sur les boîtes inoculées avec la plus haute dilution inoculée, les résultats sont exprimés qu’approximativement.