L’analyse des résultats bactériologiques révèle des insights fascinants sur les zones humides classées Ramsar d’Oran et de Bechar. Découvrez comment l’isolement de souches bactériennes et l’évaluation de leur activité enzymatique peuvent transformer notre compréhension de ces écosystèmes vitaux.
- Les milieux de cultures utilisés : (Composition chimique Voir annexe)
Nous avons utilisé une large gamme des milieux de cultures favorables aux développements des bactéries des milieux ordinaires et sélectifs (Materiels biologique).
- Les Milieu ordinaire et d’isolement :
La gélose nutritive, la gélose tergitol TTC, Tryptone Extrait de levure glucose TGEA
- Gélose nutritive ordinaire :
La Gélose Nutritive est un milieu largement utilisé pour la culture des micro-organismes peu exigeants, elle est recommandée dans de nombreuses méthodes standardisées d’analyses des aliments, des laitages, de l’eau et d’autres produits (Eaton, 1995),ce milieu de culture pour l’isolement de la majorité de la flore bactérien vue sa composition chimique équilibré et son PH neutre, contient la peptone et l’extrait de viande comme source d’azote et l’extrait de levure comme source de carbonne peut être préparé au laboratoire ainsi disponible dans la plus parts des cas sous forme de poudre commerciale déshydratée qui nécessite que l’addition de l’eau distillée et l’autoclavage (Guillaume, 2004).
Germe recherché : tous genres bactériens sans une exception.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre le déshydrata contenant la poudre de la gélose nutritive dans 1litre d’eau distillé porter à l’ébullition doucement sous un mouvement d’agitation, ajuster PH puis verser dans des flacons et autoclaver à 121°C.
Il s’agit d’une préparation liquide qui se gélifie grâce à l’agar à une température ambiante, on verse cette préparation dans des boites de pétri qui sont alors mises en incubation après l’inoculer par l’échantillon d’eau
Mode d’ensemencement et principe :
Par inondation de la surface du milieu coulé en boites de Pétri
Lecture des résultats :
Après 24 heures d’incubation à 37°C en aérobiose :
Généralement pour la recherche des bactéries aux caractères non exigeants, pour les résultats obtenus il peut y avoir des colonies de couleur caractéristiques (Guillaume, 2004).
Faire un examen macroscopique des colonie, la gélose ordinaire est un milieu de base, une culture sur ce milieu prouve la non exigence de la souche (Veron, 2013).
- Milieu TTC tergitol :
Milieu de recherche et de dénombrement des coliformes ; il est surtout utilisé pour la colimétrie des eaux par la méthode de filtration. (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Escherichia. Coli et d’autres coliformes.
Préparation et mode d’emploi :
Verser 54,0 g de poudre dans un litre d’eau distillée, porter à ébullition lentement, en agitant jusqu’à dissolution, distribuer en flacons, puis autoclaver 15 min à 121°C (AES,2009).
Liquéfier le milieu puis le refroidir vers 50°C, dans 100 ml de gélose fondue, ajouter : 5 ml de solution de Tergitol 7 à 0,2 % et 5 ml de solution de T.T.C. à 0,05 %, il est impératif de bien mélanger base gélosée et solutions aqueuses stériles en évitant l’incorporation de bulles d’air. couler en boîtes de Pétri stériles de diamètre 55 mm de manière à ce que l’épaisseur du milieu soit d’au moins 5 mm (AES, 2009).
Faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercles entrouverts, dans le cas de la méthode des membranes filtrantes, chaque échantillon à analyser nécessitera l’emploi d’une membrane (stérile, diamètre 47 mm, porosité minimum de 0,45 μm) déposées sur une boîte. Veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne s’interpose entre membrane et gélose ; puis incuber la boîte retournée à 36 °C pendant 21 heures. (AES, 2009)
Mode d’ensemencement et principe :
Méthodes de membrane filtrante (voir figure 03 annexe) ,par dépôt sur le milieu puis le faire inondé ; le principe du milieu repose sur l’aptitude des coliformes à fermenter le lactose, la production d’acide entraînée par cette fermentation provoque un virage de l’indicateur coloré au jaune et une coloration des colonies en jaune ou orangé avec formation d’un halo jaune ,le Tergitol 7 (heptadécylsulfate de sodium), additionné extemporanément au milieu de base, inhibe la pousse des germes à Gram positif, réduit l’envahissement du milieu par les Proteus et favorise le recouvrement des coliforme ,les autres bactéries à Gram négatif vont réduire le
T.T.C. (Triphényl-2, 3,5-Tétrazolium Chlorure) en formazan ce qui va colorer leurs colonies en rouge (AES,2009).
Lecture des résultats :
Colonies jaunes avec halo profond jaune sont Colonies jaunes avec halo profond jaune sont d’E.coli fécale, après 16 à 24 heures d’incubation à 44 C°
- Le milieu Tryptone Extrait de levure glucose TGEA :
La gélose glucose troponine (TGEA) correspond bien aux microorganismes des milieux aqueux (Gambro, 2002), utiliser généralement pour la recherche et le dénombrement des germes revivifiables et qui se réalisent à deux T° différentes afin de cibler les micro- organismes psychrophiles (22°C) et les microorganismes, mésophiles (37°C) (Lebres et Mouffok, 2008), Cette procédure s’applique à tous les types d’eau (Sar, 2012).
Germe recherché : Clostridium, Flavobacterium, Aeromonas……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre en suspension 19,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée puis porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, répartir en tubes et en flacons, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min (Haho, 2009) ; si le milieu est préparé à l’avance à partir du milieu déshydraté, faire fondre la gélose pendant le minimum de temps nécessaire à sa reliquéfaction totale, refroidir et maintenir à 44°C, transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives dans des boîtes de Pétri stériles ,couler 10 à 15 ml de milieu homogénéiser parfaitement ,laisser solidifier sur une surface froide enfin, Incuber :
un jeu de boîtes à (36 ) °C pendant (44) heures, et un autre à (22 )°C pendant (68 ) heures
(Haho, 2009).
Mode d’ensemencement et principe :
L’incorporation des échantillons et de leurs dilutions à la gélose s’effectue dans conditions d’asepsie sous hotte près d’une flamme de bec Bunsen ; maintenir la gélose en fusion dans un bain marie jusqu’à stabilisation de sa T° à 45°C, pendant un maximum de 4 h avant utilisation (Sar, 2012).
Après mélange vigoureux de l’échantillon, répartir les prises d’essai dans les boîtes de Pétri à l’aide une pipette à usage unique stérile (Sar, 2012).
Verser la gélose liquide de manière à obtenir une couche d’un minimum de 3 à 4 mm d’épaisseur. (Cette opération doit se faire dans les dix minutes qui suivent l’inoculation de la boîte) (Sar, 2012).
Homogénéiser ce mélange par des mouvements circulaires (3 à gauche et 3 à droite) et linéaires (3 avant – arrière et 3 gauche – droite) en évitant la formation de bulles et sans mouiller les bords supérieurs de la boîte puis laisser à refroidir les boîtes sur une surface plane (Sar, 2012).
Les substances nutritives apportées par la Tryptone et les facteurs vitaminiques de l’extrait de levure favorisent la croissance de la plupart des bactéries à dénombrer (Haho, 2009).
Lecture des résultats : (Sar, 2012)
Après solidification de la gélose, retourner les boîtes et les placer dans l’incubateur Laisser incuber dans l’enceinte réglée à 22°C pendant 68 h ou à 36°C pendant 44 heures.
Examiner les boîtes dès la fin de l’incubation si non les conserver à environ 4°C pendant 24 heures au maximum.
Lorsque plusieurs dilutions sont effectuées, dénombrer les colonies sur la gélose présentant entre 15 et 300 colonies.
Comptabiliser toutes les colonies présentes à l’aide d’un compteur de colonies.
Calcul et expression de résultats : (Sar, 2012)
Le calcul des résultats s’effectue par la moyenne des dénombrements réalisés sur les répliques de la dilution retenue (voir figure 26 page 106).
Le résultat s’exprime en nombre de germes dans le volume de référence (généralement 1 ml).
Lorsque aucune colonie n’apparaît dans la gélose inoculée avec le volume d’essai de l’échantillon non dilué, le résultat est exprimé sous la forme de « non détecté dans 1 ml ».
En présence de plus de 300 colonies sur les boîtes inoculées avec la plus haute dilution inoculée, les résultats sont exprimés qu’approximativement.
- Les milieux sélectifs : Composition chimique (voir Annexe)
Ces milieux sont rendus plus sélectifs par addition d’antibiotiques, acides aminés, sucres, colorant, Les caractéristiques, composition chimique préparation, mode d’ensemencement et principe ainsi la lecture des résultats de ces milieux seront représentées respectivement sous dessous (gélose Chapman, gélose SS, gélose Mosel, gélose nutritive AB, gélose King A et gélose King B, gélose M17, gélose VFS,gélose MRS)
- Milieu Chapman :
Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négative (Guillaume, 2004)
Germe recherché : Staphylococcus, Micrococcus……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Mettre en suspension le milieu déshydraté de la forme commercialisé dans 1 litre d’eau distillée, porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, ajuster le PH et répartir en tubes ou en flacons, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes (Haho, 2010).
Faire fondre le milieu , refroidir et maintenir à 44°C, couler en boîtes de Pétri stériles, laisser solidifier sur une surface froide, faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert, transférer 0,1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales dans les boîtes de Pétri, étaler l’inoculum à la surface du milieu à l’aide d’un étaleur stérile, incuber à 37°C pendant 24 et 48 heures (Haho, 2010).
Mode d’ensemencement et principe :
L’ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation. Ne pas sécher le milieu à l’étuve avant l’ensemencement : la déssication du milieu pourrait entraîner une augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop inhibiteur, ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L-1), ce qui permet un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en Na Cl, on peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré du rouge de phénol autour des colonies (Guillaume, 2004).
La forte concentration en chlorure de sodium inhibe la croissance de la plupart des bactéries autres que les staphylocoques, la fermentation du mannitol, mise en évidence par le virage au jaune de l’indicateur pH (rouge de phénol), permet d’orienter le diagnostic (Haho, 2010.)
Lecture des résultats :
L’utilisation du mannitol se traduira par une acidification du milieu, provoquant le virage au jaune de l’indicateur de pH ,les colonies mannitol+ sont entourées d’une aérole jaune, l’utilisation du mannitol est un caractère discriminatif important dans le genre Staphylococcus, Staphylococcus.aureus étant mannitol+, ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré ainsi des colonies pigmentées au jaune et mannitol+ : forte suspicion de S.aureus (Guillaume, 2004), les autres espèces de Staphylocoques donnent généralement des colonies plus petites, rosées et n’entraînent pas de virage du milieu ainsi d’autres microorganismes sont fréquemment rencontrés sur ce milieu : Micrococcus (colonies brunâtres à noirâtres), Bacillus (colonies brun mat).
Remarque : Le milieu Chapman permet la sélection des Staphylococcus et une orientation par l’identification de l’espèce S.aureus, mais il ne s’agit que d’un test de présomption et une confirmation par tests plus spécifique (coagulase, ADN ase…) reste obligatoire. (Guillaume, 2004)
- Milieu Gélose SS :
Gélose Salmonella–Shigella est un milieu sélectif permettant l’isolement d’entérobactérie, il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles peu pour les Shiguella car trop sélectif ceci se fait après enrichissement préalable. (Guillaume, 2004)
Germe recherché : Salmonella, Shiguella, Citrobacter……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Mettre en suspension 63,0 g de milieu déshydraté dans 1 litre d’eau distillée, porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, ajuster le PH, ne pas autoclaver (Haho, 2009).
Refroidir et maintenir le milieu à 44 °C, couler en boîtes de Pétri stériles, laisser solidifier sur une surface froide, faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert, ensemencer en stries l’inoculum à partir des milieux d’enrichissement utilisés, incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures (Haho, 2009).
Le mode d’ensemencement et principe :
Isolement par la méthode des cadrans incuber de 18 à 24h à 37°C,ce milieu contient des inhibiteurs comme les sels biliaires ,du vert brillant et une forte concentration en citrate de sodium ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries gram+positive et rendent difficile la croissance des bactéries gram-négative autres que salmonella et Shiguella ,le milieu contient du lactose pouvant être fermenté et le thiosulfate pouvant donner du H2S (Guillaume, 2004).
Lecture des résultats :
Des colonies rouges de lactose +et des colonies incolores de lactose –et des colonies à centre noir à H2S+ (Guillaume, 2004).
Les Salmonella qui ne fermentent pas le lactose présentent des colonies incolores, transparentes, avec ou sans centre noir (production d’H2S) (Haho, 2009).
Les Shiguella sont incolores et les coliformes présentent des colonies rouges ou rosées (Haho, 2009).
- Gélose Mosel :
Milieu sélectif utilisé pour l’isolement de Bacillus .cereus selon (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Bacillus……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Mettre en suspension 44,5g du milieu déshydraté dans 0,9 litre d’eau distillée, porter lentement à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le temps nécessaire à sa dissolution, faire répartir en flacons, à raison de 90 ml par flacon, stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes, pour l’usage faire fondre le milieu refroidir et maintenir à 44°C dans un bain marie chaque flacon de 90 ml de milieu de base on a lui a ajouté 10 ml d’émulsion stérile de jaune d’œuf et
1 ml de supplément sélectif la Poly myxine fournit en ampoule, homogénéiser parfaitement et faire couler en boîtes de Pétri stériles et laisser solidifier sur une surface froide après faire sécher les boîtes à l’étuve, couvercle entrouvert selon les recommandations de (Mosel et al, 1967).
Mode d’ensemencement et principe :
Transférer 0,1 ml de l’échantillon d’eau à analyser et étaler l’inoculum en surface stérilement et l’incuber à 30°C pendant 24 et 48 heures selon les recommandations de (Mosel et al, 1967), en principe la polymexine inhibe et retard la croissance des autres germes, le tryptone et l’extrait de levure favorisent la croissance des Bacillus.cereus, le jaune d’œuf additionné après autoclavage contient de la lécithine permettant la mise en évidence des lécithinases caractérisant l’espèce Bacillus.cereus finalement le mannitol +positive qui se traduit par le virage de l’indicateur coloré du rouge de phénol en jaune permettant la différenciation des bactéries contaminants le milieu des Bacillus.cereus qui sont dites mannitol – négative.
Lecture des Résultats : s’il y a croissance alors présence de la souche Bacillus cereus les caractères typiques de la colonie sont les suivant :
Le rose rouge veut dire mannitol négatif alors que l’halo blanchâtre au centre de la colonie est un signe de lécithinase positive (Guillaume, 2004).
Procéder à la sélection et à la purification des colonies douteuses pour confirmation par des études biochimiques appropriées (Mosel et al, 1967).
Pour une éventuelle confirmation du Bacillus.sp les colonies suspectes subissent une coloration de gram et une coloration de la spore (Delarras, 2007).
- Milieu King A et King B:
Le milieu King A et B ont été décrit par King, Ward et Raney en 1954 puis leur formule a été modifiée selon les recommandations de la pharmacopée américaine (King et al, 1954).
Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différentes espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques (Guillaume, 2004).
Germe recherché : Pseudomonas.f et Pseudomonas.aeruginosa……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Pour le King A : 45g de poudre par litre ; stérilisation classique ; ajouter 10 ml de glycérol après autoclavage.
Pour le King B : 37g de poudre par litre ; stérilisation classique ; ajouter 10 ml de glycérol après autoclavage.
A partir de chaque colonie suspecte prélevée sur le milieu d’isolement sélectif, puis purifiée sur gélose nutritive, ensemencer la surface inclinée de gélose King B et King A par des stries serrées. Il est nécessaire d’utiliser des cultures pures prélevées au centre de colonies bien isolées, si non les réactions croisées rendent l’identification impossible à réaliser puis incuber à (36)°C pendant 24 heures et jusqu’à 5 jours, capsules desserrées, de manière à favoriser les échanges gazeux.
Mode d’ensemencement et principe :
Ensemencer les deux milieux: King A et King B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose. Fermer les tubes sans serrer et incuber à 30°C pendant 1 à 4 jours (Delarras, 1998).
L’élaboration des pigments est influencée par la composition du milieu, ce qui justifie l’utilisation de deux milieux différents (Guillaume, 2004).
- La production de pyocyanine, due spécifiquement à Pseudomonas aeruginosa, est favorisée par la présence d’ions inorganiques et de certains acides aminés qui composent le milieu King A (Noëmie, 2011).
- La production de pyoverdine, caractéristique du groupe fluorescent, dépend de la nature des peptones, et favorisée par la teneur élevée en phosphate présents dans le milieu King B (Noëmie, 2011).
Lecture des Résultats :
La présence de pigments diffusibles se traduit par l’apparition d’une couleur qui peut diffuser sur toute la pente (Guillaume, 2004)
Sur le milieu King A : les colonies typiques sur ce milieu sont colorées en bleu-vert, parfois en brun-rose (pyorubine). La pyocyanine est extraite par le chloroforme, verser 0.5 ml de
chloroforme sur la culture, laissé la 10 à 15 min, en position inclinée : la pyocyanine très soluble dans le chloroforme, le colore en bleu (Ould Brahim ,1998 et Noëmie, 2011).
Sur le milieu King B : la production de pyoverdine se manifeste par une coloration jaune- verte, avec une fluorescence observée au UV à 340 nm ; ce pigment est insoluble dans le chloroforme (Noëmie, 2011).
Croissance à 41°C et 4°C :
Ensemencer une colonie sur deux tubes de gélose nutritive ; incuber l’un de ces tubes à 41°C, l’autre à 4°C ; procéder à la lecture après 24 à 48 heures (Rodier et al, 1996).
Pseudomonas aeruginosa peut se développer à 41°C, mais non à 4°C.
- GNAB (gélose, nutritive, alcaline, bilié) :
Très utilisé pour la recherche des vibrions surtout V.cholerae
Germe recherché : Vibrions halophiles……etc.
Préparation et mode d’emploi :
Faire bouillir environ 57,5g du déshydratas de la forme commercialisé du milieu dans 1000 ml d’eau distillé sous agitation à une T° de plus de 80 C° environ sous une plaque chauffante dont les constituants sont la peptone 20g, extrait de bœuf 5g ,5gNacl, sel biliaires des bovins et 15g agar après la dissolution complète de la poudre et l’ajustement du pH à 8,3 (Hopbiol,2011).
Répartis le volume sur des flacons de 250 ml par la suite faire un autoclavage à 121°C pendant 20 min et pour l’utilisation le milieu liquéfié est coulé en boite de pétris le couvercle semi ouvert pour le refroidissement les boites ensuite mis dans l’étuve pendant 24 h pour vérifier s’il y a eu une éventuelle contamination.
Mode d’ensemencement et principe :
Selon Guiraud, 2003, un enrichissement est réalisé en eau peptonée hypersalée alcaline (Nacl 3% et PH=8,6) pendant 6 à 24 heures à37°C, la positivité de l’enrichissement se traduit par un voile bactérienne à l’interface air/milieu, un aliquot prélevé sous la surface du bouillon d’enrichissement est ensemencé sur la gélose du GNAB après incubation à 37°Cpendant 48 heures chaque colonie subit une pré-identification (coloration de Gram et test d’oxydase) pour confirmé le genre Vibrio.sp
L’ensemencement se fait à la surface de la gélose GNAB par inondation ou par gouttes déposés par micropipette
Lecture des résultats :
Après une incubation de 18 à 24 heures les colonies de 2 à 4 mm de diamètres à contour régulier, plates, transparentes de couleur bleutée représentent effectivement le genre Vibrio (Blidapharm, 2012) ; défois les colonies suspectes d’être des vibrions apparaissent blanche bleuté lisse opaque ressemblant à un liquide laiteux.
- Milieu M17 :
Ce milieu est destiné à la culture des lactocoques dont les Leuconostoc (Terzaghi et Sandine, 1975) ainsi les Streptococcus (Haho, 2009).
Germe recherché : Streptococcus, Leuconostoc……etc.
Préparation et le mode d’emploi :
Nous avons utilisé le milieu déshydraté prés à l’emploi dont la composition et la suivante :