Les technologies d’analyse des microsatellites révèlent que 15 % des cancers colorectaux présentent une instabilité significative, transformant notre compréhension des mécanismes tumoraux. Cette étude met en lumière des implications pronostiques et thérapeutiques cruciales, essentielles pour la détection et la classification des tumeurs.
Méthode de détection de l’instabilité des microsatellites dans les cancers
La détermination du statut MSI des tumeurs peut être réalisée indirectement en étudiant l’expression des protéines du système MMR par immunohistochimie (IHC), ou directement par amplification par PCR (Plymerase chaine reaction) des répétitions microsatellites spécifiques, qui est la méthode la plus courante pour détecter le MSI (Buecher et al., 2013). De plus on peut détecter des changements dans les séquences de microsatellites par le séquençage de nouvelle génération (NGS) (Li et al., 2020).
Immunohistochimie
L’analyse immunohistochimique est largement utilisée pour étudier sur une coupe histologique l’expression tissulaire des protéines de réparation des mésappariements de l’ADN. Elle permet d’identifier la perte d’une ou plusieurs des protéines MMR (MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2); qui est causée par une ou plusieurs altérations génétiques (Wang, Kanehira and Chen, 2016). À l’état normal, ces protéines sont exprimées dans le noyau de nombreuses cellules, en particulier dans l’intestin ; par les cellules du tiers inférieur des cryptes de la muqueuse, par les lymphocytes du centre germinatif des follicules lymphoïdes et par les lymphocytes et les cellules endothéliales du stroma de la tumeur, qui servent ainsi de témoins internes positifs à la technique (Paraf, 2007).
Cette méthode repose sur l’utilisation des anticorps contre les protéines MMR qui permettent de fournir des informations sur la fonctionnalité du système MMR. L’absence d’expression d’une ou de plusieurs protéines MMR conduit à un diagnostic de MMR déficient (dMMR) tout en suggérant quel gène MMR est le plus probablement muté ou inactivé (Zhu et al., 2018).
Les protéines MMR sont généralement exprimées dans les tissus normaux et présentent une coloration nucléaire positive sur coupe histologique, ils sont considérées perdu si il y a perte complète de coloration nucléaire dans les cellules tumorales (Svrcek et al., 2019). L’analyse IHC des protéines MMR permet également l’identification de la protéine défectueuse, ainsi elle peut être utilisée pour diriger l’analyse mutationnelle du gène concerné (Richman, 2015).
Une approche à deux anticorps (PMS2 et MSH6) peut également être utilisée car les défauts de MLH1 et MSH2 seront détectés par la perte secondaire de PMS2 ou MSH6. L’interprétation des modèles de coloration IHC nécessite une compréhension de l’hétérodimérisation des protéines MMR qui se produit in vivo, par exemple : quand l’expression de MLH1 est perdue, l’expression de PMS2 est également perdue car la protéine PMS2 existe en tant qu’hétérodimère avec MLH1 et sa stabilité dépend de la formation de cet hétérodimère (Fig.10).
De même, la perte de l’expression de MSH2 s’accompagne d’une perte de l’expression de MSH6. La perte de PMS2 ou MSH6 due à des défauts dans ces gènes n’est généralement pas accompagnée d’une perte de MLH1 ou MSH2 (Tableau 1) (Geiersbach and Samowitz, 2011; Nojadeh, Sharif and Sakhinia, 2018).
La technique de l’IHC a l’avantage de pouvoir être pratiquée sur des prélèvements fixés et inclus en paraffine, quel que soit le fixateur utilisé. Mais il est en pratique difficile d’obtenir des résultats reproductibles dans toutes les conditions de fixation, les meilleurs résultats étant obtenus c’est avec le formol à 10% (Paraf, 2007).
L’IHC est une méthode qui présente de nombreux avantages ; elle est facile à mettre en place, rapide, peu onéreuse et peut être donc utilisée en routine. De plus il a été démontré que cette technique a une bonne sensibilité (> 90%) et une très bonne spécificité (100%) (Buecher et al., 2013). Cependant, plusieurs limitations sont d’ores et déjà rapportées relatives à l’absence de standardisation dans la fixation des tissus ou le choix des anticorps (Paraf, 2007).
Par ailleurs, il est généralement admis que l’IHC est moins fiable sur de petits échantillons de tissu (Zhang,
2008). À ces difficultés d’interprétation se surajoute le problème lié aux mutations faux sens, responsables d’une perte de fonction d’un gène MMR, sans perte d’expression du gène impliqué. Dans ce cas, l’IHC détecte la présence d’une protéine non fonctionnelle; le marquage IHC est positif alors qu’il y a une déficience MMR (Bellizzi and Frankel, 2009). Parmi les inconvénients de l’utilisation de l’IHC ; la coloration hétérogène qui peut rendre l’interprétation difficile dans les petites biopsies (Wang, Kanehira and Chen, 2016).
Figure 10 : L’immunohistochimie avec (A) MLH1, (B) MSH2, (C) MSH6 et (D) PMS2
(Geiersbach and Samowitz, 2011).
Tableau 1. L’interprétation de l’immunohistochimie des protéines discordantes (Wang, Kanehira and Chen, 2016).
Résultat d’immunohistochimie Gène probablement défectueux
Perte de MLH1, PMS2 MLH1
Perte de MSH2, MSH6 MSH2
Perte isolée de MSH6 MSH6
Perte isolée de PMS2 PMS2
Réaction en chaîne par polymérase
Le statut MSI des tumeurs peut aussi être déterminé par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) des marqueurs microsatellitaires spécifiques, dont l’instabilité est déterminée en comparant la longueur des répétitions des nucléotides dans les cellules tumorales et les cellules normales (Baudrin, Deleuze and How-Kit, 2018). Historiquement, un panel de cinq marqueurs des microsatellites avec sensibilité et spécificité appropriées était proposé par un Atelier du National Cancer Institute (NCI) afin de détecter les MSI des CCR (Wang, Kanehira and Chen, 2016). Ce panel connu sous le nom de panel Bethesda, comprends deux marqueurs mononucléotidiques (BAT25 et BAT26) et trois marqueurs dinucléotidiques (D5S346, D2S123 et D17S250), une tumeur est considérée comme MSI si deux marqueurs sur cinq sont instables (Söreide et al., 2006).
Par ailleurs, les tumeurs MSI dues à une altération du gène MSH6 sont indétectables sur les marqueurs dinucléotidiques alors que l’utilisation des marqueurs mononucléotidiques permet de détecter la majorité des CCR déficients pour MSH6. Cela est dû à l’incapacité du complexe protéique MSH2-MSH6 à reconnaître les boucles d’insertion/délétion de plus d’une paire de bases (Geiersbach and Samowitz, 2011).
[8_technologies-analyse-des-microsatellites-innovations-essentielles_9]L’analyse de l’ADN amplifié est maintenant réalisée avec un séquenceur d’électrophorèse capillaire automatisé utilisant la fluorescence amorces, ce qui donne une discrimination appropriée à un nucléotide conduisant à l’apparition de nouveaux pics dans le cas de MSI (Fig.11). L’amplification de l’ADN par PCR de tous les marqueurs microsatellites est généralement effectuée simultanément (multiplex PCR) ; chaque marqueur étant marqué avec un fluorophore différent à distinguer des autres (Buecher et al., 2013).
Figure 11 : Électrophérogrammes des produits d’amplification fluorescents pour les loci BAT25 de la muqueuse normale du côlon (N) et du tissu CCR (T) (Vilar and Gruber, 2010).
Quelques années plus tard, il a été constaté que l’utilisation des marqueurs microsatellites répétitifs des dinucléotides prenait en compte la confusion dans le dépistage des CCR pour MSI, alors que les répétitions mononucléotides se sont avérées plus spécifiques et plus sensibles.
Récemment, un système de PCR pentaplex composé de cinq répétitions mononucléotidiques quasi-monomorphes (BAT-25, BAT26, NR-21, NR-22 et NR-24) ont été décrites pour établir le statut MSI tumoral avec 100% de spécificité et de sensibilité et sans avoir besoin d’évaluer la lignée germinale correspondante (Wong et al., 2006; Nojadeh, Sharif and Sakhinia, 2018).
Le séquençage de nouvelle génération (NGS)
Le séquençage massivement parallèle ou le séquençage de nouvelle génération (NGS) est apparu au début du siècle actuel comme une alternative au séquençage de Sanger. Le NGS est une méthode qui permet le séquençage parallèle de milliers de courtes séquences d’ADN en un seul test, offrant une approche rentable pour détecter de multiples altérations génétiques avec une quantité minimale d’ADN (Fontanges et al., 2016; Svrcek et al., 2019).
De plus, le NGS peut être appliqué au matériel tissulaire fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE) ainsi qu’à l’ADN hautement dégradée qui est régulièrement préparé dans les services de pathologie ou trouvé dans l’ADN archivée (Baretti and Le, 2018).
Hause et al., 2016 ont développé la méthode MOSAIC pour l’analyse MSI transversale dans 18 types de cancer y compris le CCR, en utilisant les exomes de cancer de la base de données Cancer Genome Atlas (TCGA). Cette méthode, basée sur le classificateur d’instabilité microsatellitaire à arbre pondéré pour prédire le statut MSI en utilisant les fonctionnalités les plus informatives et indépendantes pour classer MSI (De’angelis et al., 2018).
Cette méthode avait une sensibilité et une spécificité élevées (> 95,0%) par rapport à la PCR correspondante et les évaluations IHC des mêmes échantillons de tissus (Trabucco et al., 2019). Cependant, le NGS reste limité à des laboratoires hautement spécialisés et nécessite des échantillons de haute qualité provenant à la fois de la tumeur et des tissus normaux.
Ces stratégies sont généralement plus coûteuses, car des machines de séquençage à plus haut débit et des pipelines de traitement de données complexes sont nécessaires (Willis et al., 2019).
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2 Définition donnée par l’article 62 de la loi sur les nouvelles régulations économiques (NRE) du 15 mai 2001. ↑
3 Auchan Les 4 Temps, La Défense. ↑
Questions Fréquemment Posées
Comment détecter l’instabilité des microsatellites dans le cancer colorectal?
La détermination du statut MSI des tumeurs peut être réalisée indirectement en étudiant l’expression des protéines du système MMR par immunohistochimie (IHC), ou directement par amplification par PCR des répétitions microsatellites spécifiques.
Quels sont les avantages de l’analyse immunohistochimique pour le cancer colorectal?
L’IHC est facile à mettre en place, rapide, peu onéreuse et présente une bonne sensibilité (> 90%) et une très bonne spécificité (100%).
Quelles protéines sont impliquées dans le système de réparation des mésappariements d’ADN?
Les protéines MMR impliquées sont MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2, qui sont exprimées dans les tissus normaux et peuvent être analysées par IHC.